Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Vlastní fluorescence proteinů Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR2 https://www.youtube.com/watch?v=vVWk-oz4Ffs Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3 Příklady fluorescence živočichů Co tam vlastně svítí? Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4 Fluorofory kolem nás Fluorofory se dělí do dvou obecných tříd: Vnitřní (vlastní, intrinsic) – vyskytují se přirozeně např. u proteinů. Vnější (nevlastní, extrinsic) – jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti. Fluorescence proteinů V proteinech jsou hlavními fluorofory aromatické aminokyseliny tryptofan (Trp), tyrozin (Tyr) a fenylalanin (Phe). Jejich absorpční pás leží mezi 240 a 300 nm, emise je rovněž v ultrafialové oblasti. Dominantním fluoroforem je tryptofan, resp. jeho indolová skupina, neboť má mnohem širší emisní spektrum než tyrozin, jehož fluorescenci umožňuje jeho fenolový kruh. Fenylalanin se na celkové fluorescenci bílkovin prakticky nepodílí. Fluorescence tryptofanu je velmi citlivá na vlastnosti jeho okolí a lze ji proto použít pro sledování konformačních změn proteinů (např. při vazbě ligandů nebo při interakcích protein-protein). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5 Absorpční a emisní spektra aromatických aminokyselin • Proteiny jsou fluorescenční díky třem aromatickým aminokyselinám: tryptofanu, tyrozinu a fenylalaninu. • Vyskytují se v sekvenci relativně málo. • Tryptofan (Trp) se vyskytuje jen asi v 1% mol, což je patrně dáno jeho poměrně metabolicky náročnou syntézou. • Tryptofan je citlivý na lokální prostředí. fluorofor ex max (nm) em max (nm) kvantový výtěžek doba života (ns) tryptofan 295 353 0,13 3,1 tyrozin 275 304 0,14 3,6 fenylalanin 260 282 0,02 6,8 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR6 Změna emisního spektra v závislosti na prostředí • Emise tryptofanu je ovlivněna okolním prostředím – lokálním elektrickým polem proteinu, polaritou rozpouštědla a iontovou silou roztoku. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/jablonski/solventeffects/index.html Polarita Iontová síla Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7 Vliv okolního prostředí v proteinu na emisní spektrum tryptofanu 1 apoazurin PFl 2 ribonuclease T1 3 nukleáza stafylokoka 4 glukagon • Tryptofan má v nepolárním prostředí emisní maximum posunuto k nejkratší vln. délce (apoazurin). • Tryptofan vystavený okolnímu polárnímu roztoku má maximum při nejdelší vln. délce (glukagon). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8 Faktory ovlivňující emisi tryptofanu • Zhášení přenosem protonu z blízkých aminoskupin. • Zhášení elektronovými akceptory (COO-). • Zhášení přenosem elektronu z disulfidů a amidů. • Zhášení přenosem elektronu z peptidické vazby kostry proteinů. • FRET mezi různými molekulami tryptofanu. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9 Emise tryptofanu v nepolárním proteinovém prostředí - azurin • Azurin z Pseudomonas aeruginasa je protein, který obsahuje měděný iont a podílí se na přenosu elektronů u denitrifikačních bakterií. • Struktura je tvořena -šroubovicí a 8 -listy, které vytvářejí strukturu -barel s velmi hydrofobním jádrem. • V nativním stavu je emisní spektrum stejné jako v případě nepolárního prostředí (např. cyklohexan). • V denaturovaném stavu se emisní spektrum posouvá, což odpovídá přechodu tryptofanu do polárního prostředí. • Emisní spektrum je rozdílné při různé excitační vln. délce, protože při 275 nm se excituje také tyrozin (peak ~ 300nm), zatímco při 292 nm se excituje pouze tryptofan. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10 Absorpční a emisní spektra aromatických aminokyselin 275 292 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11 Emise tryptofanu při záměně okolních aminokyselin • Když cílená mutageneze azurinu nahradila nepolární isoleucin a fenilalanin za polární serin, došlo k posunu spektra k delším vlnovým délkám. • Záměna za serin s OH skupinou vyvolala podobný efekt, jako by se Trp nacházel v etanolu. • Již malá změna v okolí Trp vyvolala výrazný posun spektra. N O isoleucin N O fenylalanin N O O serin Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR12 FRET mezi aminokyselinami • Mezi různými aromatickými aminokyselinami dochází k rezonančnímu přenosu energie. • FRET mezi tyrozinem a tryptofanem se vyskytuje nejčastěji, protože se nejčastěji vyskytují v sekvenci proteinů a oba jsou excitovány při 275nm. • Míra přenosu energie je dána emisním spektrem a kvantovým výtěžkem aminokyseliny, která slouží jako donor. • Míra přenosu energie je závislá na okolním prostředí jednotlivých AK. • K rezonančnímu přenosu může docházet také mezi dvěma molekulami Trp v případě, že jedna je v nepolárním prostředí a druhá je vystavena do vnějšího prostředí (polární roztok). Donor Akceptor R0 (A) Phe Tyr 11-13 Tyr Tyr 9-16 Tyr Trp 9-18 Trp Trp 4-16 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13 FRET mezi tyrozinem a tryptofanem u interferonu  • Interferon  je produkován aktivovanými lymfocyty a má antivirové a imunoregulační účinky. • Aktivita interferonu je závislá na poměrném množství dimerů. • Vlastní fluorescence interferonu, která je dána 4 tyroziny a tryptofanem, byla použita ke sledování disociace dimerů na monomery. • Emisní spektrum dimeru při excitaci 270nm ukazuje, že se na fluorescenci podílí tryptofan i tyrozin. • Při excitaci 295 nm je pozorována pouze emise tryptofanu. • Rozdíl v emisních spektrech při excitaci 270 nm a 295 nm udává spektrum tyrozinu. • V případě dimeru je relativní intenzita emise tyrozinu 20 % ve srovnání s emisí tryptofanu. • V případě monomeru je relativní intenzita emise tyrozinu 50 % ve srovnání s intenzitou tryptofanu. • Zvýšení rel. intenzity tyrosinu po disociaci je dáno oddálením tryptofanů (akceptorů FRET), které byly v dimeru v těsné blízkosti tyrozinů. • Snížení přenosu energie mezi tryptofanem a tyrozinem ukázalo, že při disociaci dochází k oddálení čtyř „vnějších“ tyrozinových zbytků od tryptofanů. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14 Využití FRET mezi aminokyselinami k určení prostorového uspořádání • Membránový protein M13 je zanořen do membrány E. coli při připojení fágové částice. • Bylo navrženo, že dvě -šroubovice tohoto proteinu jsou v membráně v těsné blízkosti. • Cílenou mutagenezí byly vytvořeny varianty proteinu, které obsahovaly tyrozin a tryptofan (donor–akceptor FRET) v různých pozicích. • Ponechán vždy pouze jeden pár tyrozin – tryptofan. • Byla sledována emise fluorescence při excitaci 280 (---) a 295 nm (…) a z rozdílu byla určena emise tyrozinu. • V případě, kdy je vzdálenost tyrozinu a tryptofanu větší, je intenzita emise tyrozinu větší. • Když jsou tyrozin a tryptofan v těsné blízkosti dochází k FRET, což výrazně snižuje emisi tyrozinu. • Snížení intenzity emise tyrozinu v případě W39Y(-15) prokázalo těsné uspořádání -šroubovic. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15 Zhášecí experiment Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR16 Zhášení fluorescence • Zhášení fluorescence lze definovat jako bimolekulární proces, který snižuje kvantový výtěžek fluorescence (tzn. intenzitu fluorescence) beze změny fluorescenčního emisního spektra. Může být důsledkem různých procesů. • Srážkové (dynamické) zhášení nastává, když je fluorofor v excitovaném stavu deaktivován (tj. navrací se nezářivě do základního stavu) při srážce s molekulou zhášedla. Molekuly nejsou při tomto procesu chemicky změněny na rozdíl od • statického zhášení, kdy se po kontaktu fluoroforu a zhášedla vytváří nefluorescenční komplex. • Samozhášení je zhášení fluoroforu jím samotným; nastává při jeho vysokých koncentracích nebo při vysoké hustotě značení. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR17 Dynamické zhášení • Snížení intenzity fluorescence dynamickým zhášením je popsáno Sternovou-Volmerovou rovnicí: F0/F = 0/ = 1 + kq 0 Cq F0 – kvantový výtěžek fluorescence za nepřítomnosti zhášedla, F – totéž za přítomnosti zhášedla o koncentraci Cq, 0 – doba dohasínání fluorescence bez zhášedla,  - doba dohasínání v přítomnosti zhášedla, kq – bimolekulární zhášecí konstanta (= bimolekulární rychlostní konstanta určená difúzí vynásobená účinností zhášení). • Hodnota kq udává koncentraci zhášedla, při které se sníží intenzita fluorescence na polovinu. • Nejčastějším dynamickým – kontaktním zhášedlem fluorescence i fosforescence je molekulární kyslík (O2). Dále fluorescenci zhášejí (v důsledku mezisystémové konverze) atomy halogenů jako je bróm a jód. Často používaným zhášedlem je také akrylamid. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR18 Jak to, že se kyslík dostane i do vnitřních oblastí proteinů? • Je malý a proteiny „dýchají“ Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19 Statické zhášení • Vytváří se komplex fluoroforu a zhášedla, který již nefluoreskuje. • Platí pro něj také Sternova-Volmerova rovnice: F0/F = 1 + Ka 0 Cq Kde Ka je asociační konstanta fluoroforu a zhášedla. Typickými statickými zhášedly jsou: Báze nukleových kyselin (hlavně Guanin) Nikotinamid Těžké kovy Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR20 Využití zhášení při lokalizaci fluoroforu V membráně • Jestliže je fluorofor P1 zanořen v membráně, je pro zhášedlo Q nedostupný a ke zhášení téměř nedochází. • S rostoucí koncentrací zhášedla se intenzita fluorescence téměř nemění. Na povrchu • Jesltiže je fluorofor P2 na povrchu, dochází k účinnému zhášení. • S rostoucí koncentrací zhášedla intenzita fluorescence velmi výrazně klesá. Zanořen v membráně Vystaven na povrchu Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR21 Zhášení při studiu struktury proteinů aneb je tryptofan na povrchu proteinu? • Dynamické zhášení vyžaduje přímý kontakt fluoroforu a zhášedla. • Když je tryptofan umístěn „uvnitř“ proteinu, nedochází k jeho zhášení (W1). • Když je tryptofan umístěn na povrchu proteinu, ke zhášení dochází (W2). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR22 Zhášení při studiu apoazurinu • Apoazurin má v sekvenci dva tryptofany. • Jeden tryptofan je na povrchu, druhý zanořený. • Po přidání zhášedla (KI) do roztoku dojde ke zhášení povrchového tryptofanu. • DS je diferenční spektrum. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR23 Vliv okolního prostředí v proteinu na emisní spektrum tryptofanu 1 apoazurin PFl 2 ribonuclease T1 3 nukleáza stafylokoka 4 glukagon • Tryptofan má v nepolárním prostředí emisní maximum posunuto k nejkratší vln. délce (apoazurin). • Tryptofan vystavený okolnímu polárnímu roztoku má maximum při nejdelší vln. délce (glukagon). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR24 Zhášení proteinů s jedním tryptofanem roztokem akrylamidu • Čím je sklon Stern-Volmerova grafu větší, tím větší je míra zhášení. • Nejlépe je zhášen tryptofan, který je volně v roztoku (reprezentován NATA- N-acetyl-L- tryptophanamide). • Nejméně dostupným pro zhášedlo je tryptofan v azurinu. Adrenocorticotropin hormone Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR25 Zhášení 2 tryptofanů v myoglobinu • Při zhášení tryptofanů u koňského myoglobinu (obsahuje 2 Trp) bylo zjištěno, že poměrná polovina intenzity je zhášena. • To vedlo k potvrzení, že tryptofan W14 je umístěn ve vnitřní části struktury mezi -šroubovicemi, zatímco W7 je na povrchu proteinu. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR26 Odvození upravené rovnice Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR27 Stanovení pořadí obsazení vazebných míst • Kalmodulin se váže na vápenaté ionty, dochází k jeho strukturní změně, což má za následek zvýšení schopnosti vazby k receptorům a proteinům, jejichž metabolismus reguluje. • Cílenou mutagenezí byl zaveden vždy jeden tryptofan do blízkosti jednoho ze čtyř vazebných míst kalmodulinu a byla sledována změna fluorescence s rostoucí koncentrací vápenatých iontů. • Porovnání závislostí ukázalo pořadí obsazování jednotlivých vazebných míst vápenatými kationty. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28 Interakce proteinu a DNA • Při interakci proteinu s DNA dohází ke zhášení tryptofanu bázemi DNA. • Protein SSB (single-stranded DNA binding) váže DNA s velkou afinitou, ale nízkou specifitou. • Vytváří homotetramer, který váže asi 70 nukleotidů dlouhou DNA. • Snížení emise tryptofanu po asociaci DNA a proteinu, ukázalo, že dochází k namotání vlákna DNA kolem tetrameru. • Označení DNA na jednom konci donorem a na druhém akceptorem ukázalo sbalení DNA kolem proteinového komplexu. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR29 Zhášení fluorescence tryptofanu v Myb oncoproteinu při vazbě na DNA • Myb onkoprotein je spojován chromatinem a reguluje genovou expresi. • N koncová část proteinu obsahuje R1, R2 a R3 doménu. • Každá z domén obsahuje tři tryptofany, které jsou v sekvenci velmi konzervovány, což naznačuje, že se podílí na vazbě k DNA. • Fluorescence R2R3 fragmentu Myb onkoproteinu je částečně zhášena po vazbě na DNA. • Po vynesení závislosti fluorescence na koncentraci DNA, bylo zjištěno, že došlo ke zhášení intenzity ze 67%. • Z toho vyplývá, že 2 ze 3 tryptofanů v každé doméně se podílejí na interakci s DNA. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR30 Protein, který má fluorescenci ve jméně Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR31 Green Fluorescent Protein • Složen z 238 aminokyselin. • „Barva v plechovce“ (“Paint in a can”). • Monomer je složen z centrální -šroubovice obklopené 11 antiparalelními -řetězci ve tvaru cylindru. • Průměr struktury je 30A a délka 40A. • Fluorofor se nachází na centrální −šroubovici.  ex= 488 nm,  em=507nm http://www.cytographica.com/animations/FRET2.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR34 Fluorofor v GFP • Ser65-Tyr66-Gly67. • Fluorofor vzniká autokatalyticky při balení proteinu ( 2-4 hod). • Tyr66 je zdrojem fluorescence. • Fluorofor vznikl oxidací Tyr66 a následnou samovolnou cyklizací. • Výsledný fluorofor obsahuje konjugované dvojné vazby. http://www.olympusconfocal.com/java/fpfluorophores/gfpfluorophore/index.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR35 Využití GFP • Lokalizace proteinů • Dynamika proteinů a organel in vivo • Transport mezi organelami • Reportér genové exprese • Flow cytometrie • Purifikace proteinů • Pohyb buněk • GFP může být použit ke značení proteinů v živých buňkách různých organismů, díky své přirozené fluorescenci (je potřeba pouze gen kódující GFP – c-DNA 1992, Prasher). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR36 Proč škorpion fluoreskuje? • Kutikula štíra obsahuje beta-Carboline (9H-pyrido[3,4-b]indole). • Je to derivát tryptofanu, který vzniká po ztvrdnutí pancíře. • Stachel, Shawn J; Scott A Stockwell and David L Van Vranken (August 1999). "The fluorescence of scorpions and cataractogenesis". Chemistry & Biology (Cell Press) 6: 531–539. Superstitionia donensis  -carboline Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR37 Příště Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR38 Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. Poděkování