Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Nevlastní fluorescence Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR3 Dá se vnitřní fluorescence proteinů použít k určení koncentrace? • Jenom ve velmi omezené míře a pouze u některých proteinů (závislost emise tryptofanu na poloze ve struktuře proteinu, vzájemné zhášení fluorescence AK přenosem energie). • Při použití vnějšího značení je stanovení koncentrace mnohem přesnější. 0 2 4 6 8 220 240 260 280 300 320 l (nm) e(M -1 cm -1 ) 0 0,5 1 250 300 350 400 l (nm) IntenzitaFluorescence Absorbance Fluorescence Trp Tyr Phe Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR4 Nevlastní fluorofory • Vnější, neboli nevlastní fluorofory se používají mnohem více než vnitřní. • Fluorescenční značky - přidávají se ke studovanému vzorku a vážou se na něj kovalentně. Vážou se na proteiny a nukleové kyseliny přes aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce a thiolové skupiny. • Fluorescenční sondy - vážou se na studovaný vzorek nekovalentně a po vazbě mění svoje fluorescenční vlastnosti (např. intenzitu, polohu em. maxima). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR5 Absorpce biologického materiálu • Biologický materiál absorbuje relativně nejméně v intervalu (500,600) nm. • Nejnižší přirozené fluorescenční pozadí je v tomto intervalu. • Také proto se používají sondy a značky, které mají excitaci a emisi v tomto intervalu. • Hlavně ale, aby mohly být značené biomolekuly studovány i za přítomnosti neznačených proteinů, musí mít značky a sondy větší excitační a emisní vlnovou délku než vnitřní fluorofory (aromatické AK) tj. 400-600 nm. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7 Fluorescenční značky • Vhodná značka pro kovalentní vazbu na biomolekulu by měla mít následující parametry: • vysoká intenzita fluorescence • stabilita i při souvislém ozařování • minimální vliv na biologické chování studované molekuly Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR8 Svítivost značky (Brightness) • je dána součinem kvantového výtěžku a molárního extinkčního koeficientu e Bs = Q e • Dobrý parametr pro účinnost s jakou značka přeměňuje excitační světlo na fluorescenci. • Po kovalentní vazbě k biomolekule často dochází k výrazné změně ve svítivosti. • Pro praxi je vhodné mít značku se svítivostí Bs > 5000 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR9 Příklady svítivosti nevlastních fluoroforů Fluorofor e (cm-1 M-1) Kvantový výtěžek (Q) Svítivost (Bs) Fluorescein (FAM) 79 000 0.9 71 100 BODIPY FL 91 000 0.9 81 900 Oregon Green® 488 87 000 0.9 78 300 JOE 71 000 0.6 42 600 TAMRA 103 000 0.2 20 600 Rhodamine Red-X (ROX) 82 000 0.7 57 400 Texas Red Alexa Fluor 594 139 000 0.9 125 100 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR10 Příklady fluorescenčních značek DNS-Cl dansyl chlorid (5-dimetylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid) 5-IAF 5-jodoacetamidofluorescein FITC fluorescein-5-izothiokyanát TRITC tetrametylrhodamin-5(a 6)- izothiokyanát Acrylodan 6-akryloyl-2- dimetylaminonaftalén NBD-Cl 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa- 1,3-diazol (4-chloro-7- nitrobenzofurazan) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR11 Dansyl chlorid • Jedna z prvních a z toho důvodu také v literatuře nejvíce zastoupených fluorescenčních značek. • Často se používá ke značení proteinů je výhodný zejména při měření anizotropie. • Velmi vhodná doba dohasínání fluorescence  ~ 10 ns. • Je excitován při 350 nm, kde proteiny téměř neabsorbují. • Emisní spektrum je velmi citlivé na polaritu roztoku a má maximum většinou kolem 520 nm. • Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů. 0 2 4 6 8 220 240 260 280 300 320 l (nm) e(M -1 cm -1 ) Absorpce proteinů Trp Tyr Phe Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR12 Fluorescein a rhodaminy • Patří k nejrozšířenějším fluorescenčním značkám. • Citlivé na polaritu solventu a na pH. • Vysoká hodnota e ~ 80 000 M-1cm-1. • Vysoký kvantový výtěžek Q ~ 0.3-0.9. • Doba dohasínání fluorescence ~ 4 ns. • je syntetizováno velké množství derivátů, které se používají ke značení proteinů a DNA přes NH2 skupinu nebo SH skupinu. • Intenzita fluorescence je závislá na pH. • Mají sklon k fotovybělování. FITC Abs.max. Em. max. fluorescein 490 nm 520 nm rhodaminy 500-600 nm 530-620 nm Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR13 BODIPY • Nástupce fluoresceinových a rhodaminových značek. • Odvozeny od fluoroforu, který obsahuje Bór. • Emisní maxima 510-675 nm. • Extrémně vysoký kvantový výtěžek Q~ 1! • Nejsou citlivé na polaritu solventu a pH. • Emisní spektrum je úzké a emise je tak soustředěna na úzký rozsah vlnových délek a může být rozlišeno více různých značek ve směsi. • Nevýhodou je malý Stokesův posuv, jehož důsledkem je poměrně malá hodnota Försterovy vzdálenosti při rezonančním přenosu energie (R0=57 A). • Díky významnému překryvu emisního a absorpčního spektra dochází k samozhášení při vysoké koncentrací značení – když jsou molekuly fluoroforů blíže než R0. • Nejsou vhodné pro FRET aplikace. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR14 Vliv přidání halogenidů na fluorescenci Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR15 Cy značky • Cyaniny jsou velmi populární. • Číslo znamená délku řetězce konjugovaných vazeb mezi dvojicí aromatických jader. • Vhodné pro oblast od 550 nm dále. • Relativně malý Stokesův posuv. • Používají se pro FRET studie. http://www.cytographica.com/animations/Cy3Cy5FRET.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR16 Alexa Fluor • Vysoký kvantový výtěžek → vysoká svítivost. • Zlepšená rozpustnost ve vodě. • Malá závislost fluorescence na pH. • Fotostabilní ! Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR17 Fotostabilita fluoroforů • Po určitém času dojde u každého fluoroforu k fotovybělení. • Nejdůležitější je fotostabilita při mikroskopii, kde se používají vysoké intenzity excitačního světla. • Nejvyšší fotostabilitu ukazují sondy skupiny Alexa. • Zatím nebyla zjištěna žádná spojitost mezi strukturou fluoroforů a jejich fotostabilitou. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR18 Vliv míry značení na intenzitu fluorescence • U klasického fluoresceinu a rhodaminů při vysoké hustotě značení (molekuly fluoroforu jsou ve vzdálenosti kolem R0) často dochází k samozhášení. • V případě Alexa fluoroforů ke zhášení v takové míře nedochází a to je důvodem vetší intenzity emise v případě vyšší hustoty značení. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR19 Real-time PCR - detekce amplifikace DNA Bi9310 ZhášedloEmitor F primer R primer 1.Značená sonda se hybridizuje s komplementární sekvencí. Záření Emitoru je zhášeno a není pozorováno. 2.Při syntéze DNA dochází k nahrazení sondy novým řetězcem. 3.Při každém amplifikačním cyklu odštěpuje polymeráza Emitor, jehož záření je detekováno. 4.Polymerizace je dokončena. Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná množství amplifikované DNA. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR20 Fluorescenční značky pro RT-PCR • Které z daných značek je nejvhodnější použít? Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR21 Fluorescenční sondy • Fluorescenční sondy jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. • Fluorescenční sondy jsou samy v roztoku zpravidla velmi málo fluorescenční. • Po vazbě na proteiny nebo DNA se fluorescence sond výrazně zvýší. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR22 Sondy citlivé na polaritu prostředí • Typické sondy pro dynamickou polaritu 1-anilinonaftalén-8-sulfonát (ANS) a 2-p-toluidinonaftalén-6-sulfonát (TNS). • Fluorescenční parametry - V tabulce jsou uvedeny fluorescenční parametry ANS v různých rozpouštědlech, odkud vyplývá, že s rostoucí polaritou rozpouštědla se emisní maximum fluorescence ANS posouvá do červené oblasti a současně klesá kvantový výtěžek a doba dohasínání • Vazba ANS k apomyoglobinu – ANS se váže do nepolárního vazebného místa pro hem, emisní maximum se posunuje na 454 nm a kvantový výtěžek fluorescence vzrůstá na 0,98. • Studium struktury a stupně polárnosti různých vazebných míst na proteinech včetně případného vytěsňování fluorescenčních sond z této vazby nebo změny vyvolané např. aktivací enzymu apod. • Použití ANS a TNS bylo použito např. pro studium polarity vazebného místa pro hem v apomyoglobinu a apohemoglobinu, nebo konformačních změn ve svalech a v nervových zakončeních během akčního potenciálu. TNS bylo využito např. pro studium konformačních změn po aktivaci chymotrypsinogenu a změn konformace nervové membrány. rozpouštědlo lem max (nm) kvantový výtěžek doba dohasínání (ns) oktanol 464 0,646 12,3 propanol 466 0,476 10,2 metanol 476 0,216 6,05 voda 515 0,004 0,55 Parametry fluorescence sondy 1-anilinonaftalén-8-sulfonátu (ANS) při různé polaritě rozpouštědla polarita Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR24 Změna fluorescence sérového albuminu v přítomnosti ANS • Při zvyšování poměru molekul ANS:SA dochází k posunu emisního maxima z 350 nm na 480 nm. • To se projeví zvýšením intenzity záření, které vidíme okem při excitaci 280 nm. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR25 DNA sondy • Interkalátory EB, AO, TOTO se vážou vmezeřením mezi páry bazí. • Hoechst, DAPI se vážou do malého žlábku DNA. • EB zvyšuje intenzitu fluorescence po vazbě 30x a  se prodlužuje z 2 na 20 ns. • DAPI zvyšuje intenzitu fluorescence nejvíc v blízkosti AT párů. • TOTO (Thiazole Homodimer) zvyšuje intenzitu fluorescence po vazbě 1100x. • Sondy s velkou afinitou jak EB homodimer (váže se 10 000x pevněji než monomer EB) a kladně nabitý TOT0 zůstávají navázané na DNA i během elektroforézy a používají se k vizualizaci DNA na gelu a umožňují zvýšit citlivost až 500x ve srovnání s klasickým barvením EB. • Jak je možno snížit spotřebu sondy při elektroforéze DNA? Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR26 Interkalace Benzpyrene TOTO Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR27 Syber Green • Selektivně se váže na ds DNA do malého žlábku. • Detekce od 1 ng/mL. • Využití při RT PCR ke kvantifikaci namnožené DNA. Taq Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR28 Srovnání sond pro kvantifikaci dsDNA Sonda Citlivost pro dsDNA Extinction Coefficient (cm-1 M-1) Kvantový výtěžek po vazbě na dsDNA Zvýšení intenzity fluorescence po vazbě na dsDNA PicoGreen 25 pg/mL 70,000 0.53 ~2000x Hoechst 33258 1-10 ng/mL 40,000 0.59 ~100x Ethidium bromid 1-10 ng/mL 5,000 <0.3 ~30x • Extinkční koeficienty byly zjištěny pro volné sondy ve vodném roztoku. http://www.promega.com/geneticidproc/ussymp8proc/21.html Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR29 Proteinové sondy • Zvyšují intenzitu fluorescence po vazbě na protein. • Nejcitlivější fluorescenční sondy pro barvení proteinů v gelu jsou ze skupiny organokovových sloučenin SYPRO. • SYPRO Red, Orange, Tangerine, Rose. • Vysoká citlivost ~ ng/mL. • Před použitím je nutná kyselá fixace. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR30 Sypro sondy • Primárně používané při barvení proteinů na gelu. • Využití v kriminalistice. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR31 Současné barvení DNA a proteinů na gelu • DNA byla barvena Syber Green. • Protein SYPRO Ruby. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR32 Indikátory iontů • Fluorescenční měření změn nitrobuněčných iontů je možně díky sondám, které mění své spektrální vlastnosti po vazbě daného iontu. Nejčastěji se měří Ca2+, kterému je věnována řada knih. Indikátory jsou obvykle deriváty chelátorů Ca2+, Mg2+, Na+ nebo K+ jako je EGTA, APTRA a BAPTA, které mají vhodnou afinitu pro studovaný iont. Při výběru vhodného indikátoru bereme v úvahu: • formu indikátoru (sůl, acetoxymetyl ester, dextranový konjugát), která ovlivňuje způsob, jakým se dostává do buňky (mikroinjekce, elektroporace, infúze z patch-pipety, pasivní difúze) a nitrobuněčnou distribuci. • způsob měření – některé indikátory vykazují po vazbě iontu spektrální posuv absorpce nebo emise (měří poměr intenzit při různých vlnových délkách excitace nebo emise), jiné změnu intenzity fluorescence. • disociační konstantu – musí být srovnatelná s měřenou koncentrací kationu (koncentrace menší než desetina nebo věší než desetinásobek disociační konstanty způsobují příliš malé změny v pozorovaném signálu). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR33 Indikace Ca2+ v nervových buňkách za použití Fluoro-3 • Pyramidový neuron z krysího hipokampu byl nejprve vystaven Alzheimerově amyloidnímu peptidu a poté excitační aminokyselině glutamátu. Zobrazování konfokální laserovou skenovací mikroskopií s použitím intracelulárního indikátoru Ca2+ fluo-3 ukazuje, že amyloidní peptid destabilizuje kalciovou homeostázu neuronu a zvyšuje jeho zranitelnost vůči excitotoxicitě. • Excitotoxicita je patologický proces, při kterém jsou nervové buňky poškozovány a zabíjeny glutamátem a podobnými látkami. Snímek od Mark P. Mattson, Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky. http://www.probes.com/servlets/photohigh?fileid=g001482&company=probes Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR34 Aplikace určení pH v nádoru https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9034243/ Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR35 Quantum dots • Základem je polovodičový materiál. • Částice o velikostí řádově nm. • Mají úzké symetrické spektrum. • Nedochází k fotovybělování! • Emisní vlnová délka je dána průměrem a materiálem částice. • Široký rozsah emise od UV do IR. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR36 Vazba biomolekul na Qdots • Jádro je tvořeno polovodičem CdS pro UV, CdSe pro Vis a CdTe pro IR. • Velikostí je srovnatelné s rozměrem GFP. • Jádro je pokryto pláštěm (shell), který umožňuje spojení jádra s vnější hydrofilní vrstvou (Polymer coat). • Vnější hydrofilní vrstva udává rozpustnost a umožňuje vazbu biologických molekul. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR37 Vlastnosti QDots • Šířka emisního spektra je 20-30 nm, což je asi 1/3 hodnoty „klasických“ fluoroforů. • Kvantový výtěžek 0.35-0.5. • Absorbují při každé vlnové délce (polovodič). • Mohou emitovat při různé vlnové délce za stejného budícího záření! • Ultrafotostabilní 100-krát odolnější proti fotovybělování než „klasické“ organické fluorofory. • Doba dohasínání ~ 100 ns. • Vysoký e ~ 10 000 000 M-1cm-1. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR38 Srovnání velikosti QDot Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR39 Aplikovatelnost fluorescenčního značení • Rozdíl mezi lidským a opičím karyotypem. • Fluorescenční značení pomáhá odpovědět na základní vědecké otázky. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR40 Datum praktického cvičení a zkoušky Potvrzení termínů cvičení Út 16.- Čt 18.1. 2024 Út 23.- Čt 25.1. 2024 Termíny zkoušky Pá 19.1.2024 v 9:00 Pá 26.1.2024 v 9:00 C02 místnost 1.21 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR41 Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006 • Haugland R.P.: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. Ninth Edition, Molecular Probes, 2002 • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. Poděkování