Fluorescenční značení molekul Fluorescenční metody ve vědách o životě - cesta od molekuly k buňce C7230 Ctirad Hofr LifeB - Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul FGP - Funkční genomika a proteomika NCBR - Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita M U N I p~Ttrum SCI biomolekul Nevlastní fluorofory fluorescenční značky - přidávají se ke studovanému vzorku a vážou se na něj kovalentně. Vážou na proteiny a nukleové kyseliny přes aminové nebo thiolové skupiny a boční řetězce. fluorescenční sondy - vážou se na studovaný vzorek nekovalentně a po vazbě mění svoje fluorescenční vlastnosti (např. intenzitu, polohu em. maxima). Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Možnosti zavedení fluoroforu • Kovalentní vazba využívá se chemické reakce derivátu fluoroforu, během které se vytváří kovalentní vazba s biomolekulou • Nekovalentní vazba fluorofor se váže na biomolekulu prostřednictvím nekovalentních např. elektrostatických interakcí • Fluorogenní reakce využívá se chemické reakce, při které se nefluorescenční prekurzor mění na fluorofor. 4 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Estery OR' Vznikají reakcí karboxylové kyseliny a alkoholu 'P '° R-c/ + Fľ-OH -► R-c' + H2° O-H O-R' karboxylová kyselina alkohol ester Fluorofory ve formě esterů jsou nejčastěji používány pro kovalentní značení biomolekul. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Vznik amidu Amidy vznikají reakcí esteru s aminem R-C O + HJM-R R-C O O-R N-R ester amin amid Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Reakce esterů při kovalentním značení molekul s NH2 skupinou NH, STP Ester O i" 2 R C-NHR Carboxamide + HO Q RlC-O-Kl Succlnlmidyl Ester R1C—NHR2 CdrbUÄdmide Využívá se reakce esteru s aminem za vzniku amidu TFP Ester Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Reakce esteru karboxylové kyseliny značky Alexa 488 s NH2 skupinou proteinu Alexa Fluor® 488 carboxylic acid, 2,3,5,6-tetrafluorophenyl ester (Alexa Fluor® 488 5-TFP) 8 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Jak přidat NH2 skupinu k DNA? Rovnou při syntéze oligonukleotidu se připojí alyfatický řetězec zakončený NH2 skupinou (amino-linker) Modifikace 5' konce amino linkerem i o Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB Značení DNA přes NH2 skupinu (CH3CH2)2N ^N(CH2CH3), O + Rhodamine Red™-X, succinimidyl ester DNA s „amino-linkerem" 10 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR DNA značená Rhodaminem Red-X a OregonGreen Další reakce pro značení přes amino skupinu Reakce isothiokyanátu s primárním aminem s R1N=C=S + R2NH2 -+ R1NH-C-NHR2 Isoth iocy anate Th i o j rea Reakce chloridu sulfonové kyseliny s aminem R1S02CI + R2NH2 -^ R1S02—NHR2 + HCI Su Ifony I chloride Su Ifo n ami d e Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP Připojení přes SH thiolovou skupinu za vzniku thioetheru s R1 R2 •Thioether je podobný esteru, jenom je O nahrazen S •Thioether vzniká reakcí alkylačních činidel (např. halogenů, maleimidů) s thioly (obsahují SH skupinu) 13 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Reakce při kovalentim značeni s SH skupinou molekul_ Reakce thiolové skupiny s maleimidem za vzniku thioetheru Dvojná vazba maleimidu reaguje s thiolovou SH skupinou za vzniku thioetheru o R -N I + R2SH Mal e i m ide Thioether Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - uaisi reaKce pro značeni moieKui se skupinou SH Disulfidy R1S-Sfl1 + R2SH Symmetric disultide R1S-SR2 + R1SH Mixed disulfide Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR "Click" chemistry o o • Reakce katalizovaná Cu2+ • azide-alkyne cyklizační chemie pro detekci A) proteinů a B) cukrů. • Reakční partneři A) L-homopropargylglycine (HPG) a Alexa Fluor 488 azide and B) A/-azidoacetylgalactosamine a Alexa Fluor 488 alkyne. • Partner vlevo je vpraven do proteinů během de novo syntézy nebo postranskripčními modifikacemi. 16 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Další způsoby značení • DNA může být kovalentně značena bez připojení NH2 skupiny při syntéze • Využívá se reaktivity N7 guaninu s platinovými komplexy • Platinový komplex obsahuje fluorescenční značku, která je po reakci kovalentně připojena ke guaninu Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB Separace nenavázané značky Chemické značení proteinů in vivo A) B) C) Receptor ^ Target Protein Target Protein Tag. 4 Enzyme Target Protein «ideTagA Enzyme f 4L ~% 4L Fluorogenic probe Target Protein Target Protein Target Protein A) Receptor-protein - fluorescenční značka nebo sonda je připojena k molekule, která má vysokou afinitu k receptoru (avidin - biotin) B) Vazba zprostředkovaná enzymem -fluorofor je připojen k substrátu, který může být kovalentně navázán na peptidový „tag" proteinu prostřednictvím dalšího proteinu/enzymu C) Značka původně nefluoreskuje. Po její vazbě k „tágu" dochází k aktivaci fluorescence (fluorogenní reakce) 19 Dragulescu-Andrasi, A., and Jianghong Rao, ChemBioChem, 2007 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Fluorogenní detekce Značení (3-gal in vivo fluorogenní sondou se změnou barvy emitovaného světla způsobenou přenosem energie. Nejdříve díky přenosu energie, fluoreskuje konjugát Donoru (D) a Akceptoru (A) zeleně. Kovalentní značení biomolekuly probíhá ve dvou krocích. 1. První krok zahrnuje štěpení O-galaktosidové vazby, při kterém se odštěpuje A vzniká reaktivní meziprodukt chinonmethid, který je náchylný k nukleofilnímu ataku blízkého zbytku aminokyseliny. 2. V druhém kroku dochází ke kovalentnímu připojení Donoru k molekule, který může zářit modře, protože již není navázaný Akceptor. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR DNA beacons I - Target DNA Sequence complementary to target DNA IIIIIIMMII Fluorophore Quencher Hybrid •Beacon zn. angl. signální oheň (ne slanina) • DNA beacon sestává z molekuly DNA, která je schopna tvořit vlásenkovou strukturu •DNA má na jednom konci připojen fluorofor a na druhém jeho zhášedlo • Při hybridizaci s komplementární DNA dochází k oddálení zhášedla a následné emisi fluorescence 22 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Struktura a vlastnosti „DNA beacon" Při zvyšování teploty dochází k tání struktury vlásenky, což se projevuje vzrůstem intenzity fluorescence 0" EDANS Dabcyl Pozn. V případě Dabcylu byla zjištěna neočekávaná schopnost zhášet široké spektrum fluoroforů bez ohledu na míru překryvu spekter. Důvodem pro toto univerzální zhášení je pravděpodobně vytváření nefluorescenčního komplexu Dabcylu s fluoroforem. Každopádně je to výhodné, protože jedno zhášedlo může být použito pro celou řadu fluoroforů. 23 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Vysoká citlivost „DNA beacon" 0 5 10 15 TIME (minutes) • V případě, že dojde k hybridizaci s DNA, která se liší i pouze v jednom nukleotidu, nedochází k nárůstu signálu fluorescence. • Vysoká citlivost a poměr on/off signálu v přítomnosti / nepřítomnosti komplementární DNA. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB Použití Dabcyl-Fluorescein páru na „DNA beacon" ke sledování PCR 1.0 NCE 0.8 LU O (/) 0.6 LU OĹ O 0.4 -J U. 0.2 0 Počet molekul DNA beacon ve vzorku 10000 000 1000000 100 ooo 10 000 1000 20 30 40 CYCLE NUMBER 50 Intenzita fluorescence je přímo úměrná množství amplifikované DNA 25 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Hybridizace v sousedních oblastech Donor beacon Acceptor beacon Exor>6 Exon 7 Target S-T6ACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATG/ACCACAGTCCATGCCATCACTCCCACCCA -3' (.ACCATAGCACCTTCCTGAG GGTGTCAGGTACGGTAGT„ y £ Cy3 r am ^s' / Acceptor Beacon Oonor Beacon \ Oabcyl Dabcyl 1.2 £ 1.0 h i/) Ľ 0.8 - PA|V| Donor and acceptor beacons, no target D+T Donor beacon with target A+T Acceptor beacon with target D+A+T Donor and acceptor beacons with target 26 500 525 550 575 600 625 EMISSION WAVELENGTH ( nm ) 650 Výhodné uspořádání ke snížení falešně pozitivních výsledků Používají se dvě vlásenky Jedna vlásenka obsahuje donor a druhá akceptor FRET Bez cílové DNA jsou oba fluorofory ve vlásence zhášeny V případě, že dochází ke správné hybridizaci s cílovou DNA, je pozorován FRET Když se hybridizuje pouze jedna vlásenka, dochází sice ke zvýšení intenzity, ale nezvyšuje se FRET Tímto způsobem je zaručena specifita analýzy Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Detekce mRNA v živých buňkách • Optické a fluorescenční zobrazení ledvinových buněk • Zvyšování intenzity fluorescence „DNA beacon" proti mRNA pro (3-aktin prokázalo zvýšení koncentrace mRNA a tedy zvýšení produkce (3-aktinu 27 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR FISH - fluorescence in situ hybridization Metaphase chromosomes DNA Probes Hybridization glass slide Fluorescence detection 28 DNA ve formě metafázových chromozomů je vystavena hybridizaci s fluorescenčně značenou DNA sondou DNA sonda má sekvenci komplementární k cílové DNA na chromozomu Po hybridizaci je část obsahující cílovou DNA lokalizována na základě fluorescence Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Fluorescenční deoxyribonukleotidy pro syntézu FISH DNA sond FISH příklady Chromozomy, které byly hybridizovány s fluorescenčně značenými sondami Chromozomální DNA byla nespecificky obarvena DAPI 30 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Radioaktivní sekvenování 2' ssDNA of Unknown Sequence 3' I I I I I I I I I I I I I I I I G C G G T CCG A Í G C G C A G C G T w I I I I DNA polymerase I + i. dNTPs + U ddNTPs 3' 5. Labeled ' \ primer Dyel \ dd TP D O o -o É o 5' 1 o T a c en o c cr o 3' 31 Prvotní sekvenování používalo radioaktivně značený primer Primer byl prodlužován podle sekvenovaného řetězce DNA polymerázou Ve směsi normálních nukleotidů (dNTP) byl přidán vždy jeden typ (ddNTP), který zabraňuje dalšímu prodlužování syntetizovaného řetězce Takto vzniká směs řetězců DNA s proměnlivou délkou končící vždy daným ddNTP Každá reakční směs pro daný ddNTP byla analyzována v jedné elektroforetické jamce (celkově ve 4 jamkách) Sekvence byla stanovena z polohy pásu příslušného ddNTP na gelu Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Schéma ddNTP DNA 5' O" O" O" I I I "O- P- O- P - O- P - O- CH2 O O Phosphate group Not available for phosphodiester bond formation ,\1 Fluorescent Probe I Pyrimidine or Purine base Pentose sugar ddNTP d NTP Hydroxyl group in DNA Dideoxynukleotid-trifosfát ddNTP V poloze 3' u ribózy je zaměněna OH skupina za H, což zamezuje dalšímu prodlužování řetězce DNA OH Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB Fluorescenční značení zrychlilo sekvenování 5' ssDNA of Unknown Sequence 3' I I I I I I I I I GCGGT'. CCG I I I I I I I A A G C G C A G C 6 T 1 I I I DNA polymerase I + A ddNTPs + i fluorescent ddNTPs v o u ■o 6 a >s L_ O < 3' 5' Unlabeled primer 5' a c i- O cr 00 I G-50S 1 C-519 T-526 Použití 4 fluorescenčních značek umožnilo použít pouze jednu dráhu v gelu k identifikaci všech čtyř nukleotidů => 4-násobné zrychlení Fluorescenční skenování umožnilo dokončit projekty sekvenace genomu celých organismů ve výrazně kratší době Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP Fluorescenční značky pro sekvenaci 400 440 480 520 560 34 CH, - m °HO,P,0-i,CxJ G-505 \J N H, 480 \ TERMINATORS 520 560 WAVELENGTH (nm) 600 Připojení značky pres acetylénovou trojnou vazbu Všechny značky se excitují jedním laserem (488 nm) A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides JM Prober, GL Trainor, RJ Dam, FW Hobbs, CW Robertson, RJ Zagursky, AJ Cocuzza, MA Jensen, and K Baumeister Science 16 October 1987238:336-341 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Human genome sequence >< t human ^ chromosome J*;;^o^%^ sequence Impacts of foreseeable science • Supplement with this issue ' • Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1 .IŤ1 .cuni.cz/~zTisar/Tluorescence/DeTault.htm Poděkování Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J. R. Lakowitzem. 36 Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Příště 2 in 1 Analytické stanovení 0 200 400 600 800 1000 CDNA(n9/ml) 37 Mikroskopie Peltier-Cooled CCD Camera Eyepieces Breathshield (UV Shield) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr - LifeB | FGP | NCBR Zhášecí konstanta Ksv z rovnice regrese is.muni.cz/el/1431/podzim2014/C7230/um/9156087/RovniceRearese Excel 1 .mp4