Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Fluorescenční metody ve vědách o životě – cesta od molekuly k buňce C7230 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Analytické aplikace fluorescence 2 Určení koncentrace DNA • Pomocí absorpční spektroskopie je možno přesně určit koncentraci až do limitu 1 g/ml • Použití fluorescenční sondy umožňuje snížit limit detekce 1000krát – na 1 ng/ml! • Při použití fluorescenčních sond na měření koncentrace komplexních vzorků (buněčný lyzát, krevní plazma) je menší vliv přítomnosti proteinů (absorbují při 260 nm), nukleotidů a krátkých oligonukleotidů. • Přesnost měření je kolem 5%. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR 3 Stanovení koncentrace DNA pomocí Hoechst 33258 • Standard – roztok DNA od 5 - 1000 nM • Smíchání s roztokem Hoechst (200 ng/ml) v poměru 1:1 • Ex/Em 350/455 nm • Měřeno v TE pufru • Spotřeba vzorku ~ 50 ng DNA Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR 4 Stanovení koncentrace DNA pomocí PicoGreen • Detekce 25 pg/ml • Ex/Em 480/520 nm • Velký dynamický rozsah – lze stanovit koncentraci od 0,025 - 1000 ng/ml Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR 5 Určování koncentrace proteinů • UV absorpce – stanovení na základě absorpce aromatických AK – je závislá na jejich výskytu v sekvenci (1 mg/ml) • Bradfordova metoda – založená na změně zbarvení po vazbě na protein (0,25 mg/ml) • Fluorescenční metody (10 ng/ml) Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR 6 Fluorescenční stanovení koncentrace proteinů • Při použití fluorescenční sondy NanoOrange je potřeba vyrovnat rozdíly ve struktuře proteinů, které by ovlivňovaly interakce – je nutno je zdenaturovat • Citlivost 10 ng/ml • Dynamický rozsah 1000 • Stabilní po dobu 6 hod • Malá závislost na typu proteinu • Metoda není citlivá na kontaminaci jinými molekulami než lipidy • Pro kvantifikaci v přítomnosti lipidů nebo lipoproteinů lze použít CBQCA kitBSA A) BSA, trypsin, carbonic anhydrase B) IgG, streptavidin, RNase A Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR7 Quantification using the Qubit Fluorometer https://www.youtube.com/watch?v=y3iKA5T5fnI 8 Stanovení množství za použití densitometrie gelů • Při analýze molekul v gelu je možno získat současně informace o kvalitě i kvantitě • Měří se množství absorbovaného/emitovaného světla v závislosti na 2D poloze • Stanovení koncentrace DNA a proteinu po barvení gelu Coomasie, stříbrem nebo fluorescenčně (SYBR Green, SYPRO Ruby) Zdroj světla Detektor Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR 9 Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J. R. Lakowitzem. Fluorescenční metody | C7230 | Ctirad Hofr – LifeB | FGP | NCBR Poděkování