> Molekulová dynamika a její využití při studiu efektu mutací > > > Molekulová dynamika Forma počítačové simulace, kde atomy vzájemně interagují po daný časový interval na základě aproximací fyzikální chemie. Původní záměr MD: oblast teoretické fyziky 50. léta 20. stol. (Alder and Wainwrigh, studium tuhých koulí) Alder, B. J. and Wainwright, T. E. J. Chem. Phys. 27, 1208 (1957) Alder, B. J. and Wainwright, T. E. J. Chem. Phys. 31, 459 (1959) Současnost: 1. Materiálové vědy a nanotechnologie: fyzikální vlastnosti nano-systémů 2. Biovědy: Studium konformačních změn molekul (foldování), určení termodynamických veličin, studium elasticity molekul, interakce DNA-protein, protein-léčivo, určené vazebné energie 3. Refinement Xray a Nmr struktur, > Vstupem do simulace je 3D struktura PDB databáze: archiv 3D struktur > Stavění modelu pro simulace: molekula + ionty + voda > Simulace na klastrech, Analýzy na lokálních PC. Fi Fi Fi Fi vývoj vývoj vývoj 1fs 2fs 3fs Systém je popsán pomocí silového pole: V(r) = ΣKb(b−b0)2 +ΣKθ (θ −θo)2 + Σ(Vn/2)(1+cos[nφ −δ] + Σ (Ai j/r12 i j )−(Bi j/r6 i j) +(qiqj/ri j) harmonický potenciál chem. vazeb harmonický, determinuje změny vazeb.úhlů periodický potenciál pro torzní úhly Van der Waals člen –Lennard-Jones p. Elektrostatická interakce Derivace potenciální energie podle souřadnic atomů Komplexní systémy MD není možné řešit analyticky Integrace Newtonových pohyb rovnic se řeší numericky.. Metoda konečných diferencí … rešení v čase t+δt Forces: Fi = - V(r) Fi= mai = m d2r/dt2 •Studium termodynamických veličin, H, S, G •Studium interakace s ionty, vodou, ligandem •Studium flexibility a elasticity molekuly •Studium dynamiky párů bázi nebo aminokyselin /mutací Příklad: Využití MD při studiu PAH mutací Non-PKU HPA/mild PKU R408W > Missense mutací způsobují misfolding > PES - potential energy surface > Závislost energie na geometrii > > Protein folding Energy state of protein folding under physiological and misfolding conditions. > > Vabulas R M et al. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010;2:a004390 Seeking lower energy levels and more stability, unfolded proteins have a tendency to aggregate. > > Propagace konformačních změn – Patologicky konformovaný protein indukuje změnu konformace i u normálně konformovaného proteinu. Tento mechanismus se uplatňuje především u prionových onemocnění. Selhání proteolytického procesu – Proteolytický proces chybně konformovaného proteinu může proběhnout nestandardně a zbyde špatně degradovatelný proteinový zbytek. Tento mechanismus se uplatňuje např. v patogenezi Alzheimerovy choroby. Mutace genu pro prekurzorový protein – V některých případech je patologická konformace způsobena zárodečnou mutací v genu. Jde o případ dědičných amyloidóz. Nadprodukce – Přílišná produkce fyziologického proteinu může sama o sobě zvýšit riziko vzniku kondenzačních jader amyloidových fibril. Podílí se na patogenezi zejm. lokalizovaných amyloidóz. Porucha kontroly kvality sestaveného proteinu. Vznik amyloiních struktur > Příklad: > Antiparallel beta-sheet: a signature structure of the oligomeric amyloid beta-peptide. > > > Amyloidní fibrily: strukturované agregáty nerozpustné, buňka je nedegraduje Během formování amyloidu se α-helixy mění na β-skládané listy Aβ způsobuje neuorotoxicitu, ničí neuronové buňky > > > Strukturní mutace vedoucí k misfolding Až ½ lidských onemocnění je způsobena špatným sbalením proteinů, patří sem i mutace v p53. Misfolded protein = ne-nativní špatně sbalená proteinová struktura > > Amyloidy mohou vznikat z různých proteinů a mohou se kumulovat v různých tkáních (ledviny, srdce, střeva, játra, kůže..) Nejsou metabilizovány a odbourávány z těla, takže je jen otázkou času kdy začnou narušovat funkci orgánů. Důvod toxicity amyloidních struktur?? - Agregáty se začleňují do membrány a depolarizují ji dochází ke změně akčního potenciálu. Důsledkem je programovaná smrt buňky (apoptóza) nebo nekróza, která může vést k zánětlivým reakcím. > K misfolding může dojít z různých důvodů > Přítomnost misfodovaných proteinů indukuje záchrané akce > Chaperony: (heat shock or stress proteins) Klasifikace: Podle molekulové hmotnosti (kDa): (Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 and the so-called small Hsps) Podle mechanismu účinku: •Foldázy - HSPP60, HSP70, HSP90 foldování pomocí ATP (mají ATP-azovou doménu a substrátovou) •Holdázy – HSP40, HSP33 nevyužívají ATP > > Chaperony asistují při foldování řady velkých proteinů, (např tubulin nebo aktin), kde stabilizují přechodné intermediáty, čímž umožňují vznik správné konformace. Při foldování z jednoho stavu do druhého, u těchto proteinů, existují velké energetické bariéry Další funkce: asistence při transportu a proteolytické degradaci Funkce chaperonů za normálních podmínek (není přítomen buněčný stres) > •Chaperony váží hydrofóbní místa unfoldovaného proteinu (samotná vazba zabraňuje agregaci neboť stíní hydrofóbní místa) •Uvolněná E z vazby ch-p se využije na narušení vazeb v misfodovaném proteinu, což umožní nové přeskládání nebo využívá E z ATP-hydrolýzy ve své ATP-azové doméně •Chaperon se váže cyklicky a různě na misfoldované proteiny umožňuje znovu sbalení = iterative anealing •Transfer entropie – neuspořádaný chaperon se vazbou uspořádá a naopak misfoldovaný protein se rozbalí Při foldování mohou vzniknout tzv. dead-end konformace, které se již nedají pomocí chaperonů přeskládat do funkční struktury. > Mechanismus účinku chaperonů u misfolded proteins > > Terapie – protein misfolding diseases •Využití protilátek k blokování proteinových agregátů •výroba farmakologických nebo chemických chaperonů (malé molekuly) > Aktivní místo > > > BH4 Fe3+ L-Phe L-Tyr > > > Phenylalanine hydroxylase onemocnění: Hyperphenylalaninemia (fenylketonurie) recesivní Př: Někteří pacienti dobře reagují na podání tetrahydrobiopterinu (BH4), který je přirozeným kofaktorem PAH a který působí jako farmakolo- gický „chaperone“. BH4 zvyšuje termální stabilitu a ochranu proti proteolytické degradaci a oxi- dační inaktivaci mutovaného proteinu,