Patogenní kvasinky
Světová Zdravotnická Organizace (WHO) poprvé v roku 2022 uveřejnila seznam život ohrožujících hub
úspěchy moderní medicíny způsobily rozmach kvasinkových/houbových infekcí (používání imunosupresiv, kortikoidy, nadužívaní antimykotik)
1/10,000 ze ~ 5 milionů odhadovaných druhů hub které obývají naši planetu může napadnout a způsobit nějakou formu onemocněni u člověka (300 známých druhů, 2 miliony mrtvých ročně)
Houby/kvasinky způsobující choroby u lidí pocházejí ze skupiny způsobující nekrózy u rostlin (nekrotrofy) anebo je požírají již mrtvé (saprotrofy), kdežto symbiotické houby rostlin jen málokdy napadají lidi
Lidi jako endotermní savci jsou přirozeně rezistentní vůči kvasinkám, velmi málo hub dokáže růst nad teplotou 37 C
Condido ouris nejnovější patogen (celosvětová hrozba)
• multi-rezistentní vůči běžným antimykotikům;
•je obtížně identifikovatelná běžnými laboratorními metodami, může dojít k záměně s jinými kvasinkami;
• snadno se šíří ve zdravotnických zařízeních
Kvasinkové patogeny
Candida Cryptococcus
Malassezia
Trichosporon
Rhodotorula
Hansenula Torulopsis
Geotrichum
Saccharomyces
> 70-90 % onemocnění kvasinkami jsou kandidózy
> počet druhů působících jako etiologické agens a účastnících se patologických procesů u člověka, se zvyšuje
> Většina kvasinkových druhů je nepatogenní, patogenními se stávají v podmínkách poruch imunitní odpovědi
Přehled onemocnění způsobených patogenními houbami
Aspergillosis (Aspergillus s
Blastomycosis (Blastomyces s
Candidiasis (Invasive) (Candida s
Coccidioidomycosis
Cryptococcosis (Cryptococcus s
Histoplasmosis (Histoplasma caps1
Mucormycosis (Mucor
Paracoccidioidomycosis
Sporotrichosis (Soorothrix schenckii
íkía kjsitaniaĚ
Astomycutä
:ylogenetická analýza 1,644 druhů, červené jsou patogení
> My kozy:
• primární
• oportunní (u imunokompromitovaných pacientů - AIDS,
leukémie, diabetes, popáleniny, terapie kortiko-steroidy, imunosupresivy)
• Systémové - plíce, játra, srdce, mozek, slezina
• Lokální - kůže, ústní dutina, vagina aj
> forma a závažnost infekce závisí na:
- infekčním agens (druh, množství)
- způsobu a bráně infekce
- stavu imunitního systému hostitele
> endogenní infekce (autoinfekce) zdrojem jsou komenzálové člověka (přirozeně se vyskytující kvasinky v tele člověka) - při porušení homeostázy, vnímavosti a rezistence
> povrchové mykózy - nakažlivé
Některé mykózy mají charakteristickou geografickou distribuci:
Coccidioidomycosis: jihozápad USA a severní Mexiko
Histoplasmosis: jižní oblasti USA Blastomycosis: USA a Afrika Paracoccidioidomycosis: Jižní Amerika Sporotrichosis: Střední Amerika, Mexiko
Mechanizmus patogenicity
Sekretované houbové hydrolázy napomáhají invazi do tkání Tvorba biofilmu chrání kvasinky
Switching (změna expese genů, hyfální růst) napomáhá modulovat antigenicitu
Diagnostika:
> kombinace   klinického  pozorování a laboratorního vyšetření
> Laboratorní vyšetření:
• mikroskopický průkaz
• kultivační průkaz
• sérologické metody
Mikroskopicky průkaz
povrchové mykózy - šupinky kůže, části nehtů, seškrab kštice s vlasovými kořínky a
kožními šupinami
kandidóza - stery sliznic
systémové infekce - vzorky tkání z více míst
přímá mikroskopie:
- ve vlhkých preparátech po natrávení tkáně 10-20% hydroxidem draselným
- infekce sliznic - Gramovo barvení
- morfologie buněk histologické vyšetření
Kultivace
- většina kvasinek snadno kultivovatelná (Sabouraudův agar)
(glukóza, sladinový agar, hydrolyzát kaseinu + chloramfenikol nebo gentamycin) Czapek - Doksův agar a jiné
- současně při 25 - 30°C a 37°C
- doba kultivace 1 - 5 dnů
Levné ale pracné a časově náročné
auxanogram - test na asimilaci cukrů a dusíkatých látek (zdroj C), provádí se na miskách (použití cukerných disků)
Komerční testy
rychlé dostupné identifikační soupravy
jamky obsahují dehydratované substráty (cukry, organické kyseliny, aminokyseliny), test na stanovení citlivosti k cykloheximidu a jeden kolorimetrický test (eskulin)
Nárůst kvasinky v jednotlivých jamkách lze hodnotit buď vizuálně nebo pomocí automatického čtecího zařízení
Sérologie
Průkaz specifických protilátek: (protilátková odpověď slabá)
Protilátky proti kandidám jsou často přítomny i u zdravých osob, protože každý jedinec se během svého života setká s kvasinkami
Dojde-li však k rychlému vzestupu titru protilátek, svědčí to o přítomnosti kandidové infekce
Průkaz antigénu: detekci hlavního glykoproteinu buněčné stěny
kandid - mananu, systémové kandidózy ELISA: imunoenzymatická metoda
Molekulárně-biologické metody
velmi citlivá a rychlá - detekce jen několika kopií genu (24-72 hodin), nested PCR
Použití pro konzervované, ale i variabilní úseky genomu - specificita pro určité rody nebo druhy (rDNA, mitochondriální DNA, jiné DNA]
kvantifikací lze odlišit kolonizaci od aktivní infekce (real time PCR)
použitím multiplex PCR ke možné detekovat více druhů v jedné PCR reakci
Časté falešné negativity:
neúčinná metoda izolace DNA
nadbytek lidské DNA ve vzorku (kompetice)
Testy jsou zatím nestandardní
Metody ve fázy testování
matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI] fluorescence in situ hybridization (FISH]
Antimykotika
kvasinky  -  eukaryontní  buňky -  běžná antibakteriální antibiotika jsou neúčinná
Terčové struktury antimykotik:
buněčná stěna (glukan, manoproteiny, chitin)
plasmatická membrána (míst cholesterolu obsahuje ergosterol)
cytoskelet (kvasinky neobsahují interdmediální filamenta RNA (narušení syntézy bílkovin)
Antimykotika —► toxický účinek na hostitele
Příklady antimykotik
- perorálně: ketokonazol, terbinafin
- Parenterálně (injekce/infuze):
amfotericin B, mikonazol...
(malá vstřebatelnost z trávicího ústrojí)
- parenterálně i perorálně:
flukonazol, itrakonazol, flucytozin...
Azolové deriváty
a) 2-nitroimidazoly :
klotrimazol, mikonazol, ketokonazol
b) triazoly :
itrakonazol (kandidózy, kryptokokózy) flukonazol (perorálně - kryptokoková meningitida) - existuje primární i získaná rezistence k azolovým sloučeninám
kyselina benzoová
(Whitfieldova mast) - povrchové mykózy
polyeny
- toxické, ukládají se v nově tvořeném keratinu
nystatin (kandidózy)
amfotericin B (kandidózy, kryptokokózy)
griseofulvin - proti dermatofytumjmidazoly, kyselina nalidixová fluoropyrimidiny, kandicidin
kombinace antimykotik
Chemická skupina Antimykotikum
Mechanizmus účinku
Polyenová antibiotika Amfotericin B Nystatin_
fungicidní účinek in vitro; vazba na ergosterol
v cytoplazmatické membráně, vznik pórů, únik iontů a
bílkovin (enzymů) a přesun jiných molekul do buňky
Azolové deriváty Imidazoly
Mikonazol
Ketokonazol Triazoly 1. generace
Flukonazol
Itrakonazol Triazoly 2. generace
Vorikonazol
Posakonazol
Ravukonazol
převážně fungistatický účinek celé skupiny (cidní účinek vorikonazolu na aspergily), společný mechanizmus účinku, blokáda enzymatických systémů závislých na cytochromu P450 (inhibice 14-a-demetylázy); inhibice syntézy ergosterolu, poškození funkčnosti plazmatické membrány, zpomalení až zástava růstu
Antimetabolity Flucytosin (5FC)
vstup 5-FC do buněk pomocí membránové cytosin-permeázy; deaminace na 5-fluorouracil; zabudování jako falešný prekurzor do RNA houby na místo cytosinu; blokáda proteosyntézy a thymidylát syntetázy (inhibice syntézy DNA)
Echinokandiny Kaspofungin Anidulafungin Mikafunqin	inhibitory buněčné stěny hub (specifické nekompetitivní inhibitory (3-(1f3)-glukan syntázy); deplece (3-(1 f3)-glukanu a osmotická destabilizace buněčné stěny houby
Allylaminy Terbinafin Naftifin	specifická vazba na skvalen epoxidázu; inhibice biosyntézy ergosterolu
Thiokarbamáty Tolnaftát Tolciklát	specifická vazba na skvalen epoxidázu; inhibice biosyntézy ergosterolu
Morfoliny Amorolfin	specifickou vazba na A14 reduktázu/A'-Ay izomerázu, inhibice biosyntézy ergosterolu
Benzofurany Griseofulvin	interference s mitotickým vřeténkem, inhibice mitózy a poškození syntézy nukleových kyselin
Povrchové mykózy
Povrchová kandidóza:
- postižení kůže, nehtů, sliznic úst a pochvy (infekce sliznic -„moučnivka")
- 80 - 90% Candida albicans, zbývající případy další druhy (C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. glabrata...)
- 20% lidské populace - C. albicans součást komensální flóry pokožky a sliznic
- výskyt závisí na stavu organismu - bakteriální či virová infekce, těhotenství, aj
25°C
Yeast Levures
37°C
Hypha Hyphe
		
		
1 1		
37°C
A
Pseudohyphae Pseudohyphes
Identifikace:
- Sabouraudův glukózový agar - kvasinková fáze (oválné
buňky, 3-8 |jm), kolonie za 1-2 dny při 25°C
- in vivo - směs kvasinkových buněk, pseudomycelia a
pravého mycelia, parasexuální cyklus (fůze hýf, diploidizace, rekombinace, mitotický crossing-over, haploidizace)
- po obarvení dle Grama: grampozitivní oválné pučící buňky Candida albicans
- tvorba charakteristických klíčků (po 90-120 minutách inkubace v séru při 37°C)
- další identifikace: soupravy, testy fermentace a utilizace cukrů a zdrojů dusíku
Léčení:
- lokální terapie nystatinem, amfotericinem B, mikonazolem
- vaginální kandidóza - azolové deriváty, azolové poševní
čípky u recidivujících případů
Infekce sliznic:
- nejčastější povrchové kandidózy
- na sliznici ohraničené bílé skvrny, mohou splývat a vytvářet pseudomembrány (tvarohový vzhled)
infekce dutiny ústní:
- bukální sliznice, tvrdé patro, okolí bílých skvrn zarudlé
- kojenci, staré osoby, osoby se sníženou imunitou (AIDS)
- umělý chrup - infekce pod protézou
infekce kůže a nehtů:
- v tříslech, mezi prsty, v podpažní jamce, pod prsy (v místech
vlhké zapářky) =^=====^
- postižení nehtu a nehtového lůžka - při častém máčení rukou
(ošetřovatelky, myčky nádobí)
Mykotické plaky na zubech
Původce: většinou Candida albicans, souvislost se stravovacími návyky
Pityriasis versicolor
- chronická infekce způsobená lipofilní Malassezia furfur
- odbarvené skvrny na kůži
M. furfur
- běžný komenzál na kůži, většina infekcí je endogenní
- vyžaduje k růstu lipidy; monopolárně pučící (jediný rod)
- oválné lahvovité buňky, velikost 2-3 x 4-6 pm, při pityriasis versicolor kvas in kovité buňky s krátkými hyfami
- kultivace - speciální půdy s Tweenem nebo lipidy (37°C)
- podílí se na tvorbě lupů a seboroické dermatitidě
Systémové mykózy
Kryptokokóza:
- způsobuje Cryptococcus neoformans
vytvářející hladké lesklé kolonie, kolem buněk silné pouzdro
- onemocnění CNS a plic
- sporadicky po celém světě, nejčastější u pacientů s AIDS (u 10%)
- prostředí - alkalické substráty bohaté na dusík
Průkaz
mikroskopicky: v mozkomíšním moku a dalším klinickém materiálu - kulovité buňky 2-10 um
s mukopolysacharidovým pouzdrem (až 60 % izolátů) - po smíšení mozkomíšního moku s tuší se pouzdro jeví jako jasný dvorec kolem buněk
kultivace: - na Sabouradově agaru při 25-30°C a 37°C za 2-3 dny
- smetanově bílé až žlutohnědé mukózní kolonie (neopouzdřené kmeny - suché)
- netvoří pseudomycelium ani mycelium
- nefermentuje cukry, silná produkce ureázy,
asimilace inozitolu
Blastoschizomyces capitatus
(dříve Trichosporon capitatum)
-diseminované infekce
- oslabení neutropeničtí pacienti se zhoubnými lymfomy
- asimilace pouze glukózy a galaktózy
Geotrichum candidum
- infekce u diabetiků,
" ováných osob
cerevisiae
- sepse a plicní infekce
původce vaginální mykóz (8,5 %)
v
o
Rhodotorula
- barevné kolonie (oranžové, červené)
- neasimiluje inositol
Dimorfní houby
vláknitá fáze
- většinou saprofytická (průnik přes kůži a sliznice)
kvasinková fáze
- infekční (hluboké infekce tkání a orgánů)
- kvasinkový rust podporují bohatější pudy
krevní agar) a teplota - tvorba hyf - teplota 25-30°C
Dimo
ge
Fungus
In vitro (25° C)
In vivo (37* C)
Blastomyces
Coccidioides
Histopiasma
Paracoccidioides
Sporothrix
Mold
Mold
Mold
Meld
VrAl
f     j Yeast
Spherule
roast
:0
Yeast
d?
Yeast
Blastomyköza, kokcidiomykza, sporotrichöza etc.
Sporothrix schenckii
buňky ve fázovém kontrastu - hyfy a konídie
Sporothrix schenckii
studie buněk freeze fracture technikou
Sporothrix schenckii
. studie buněk freeze-fracture technikou
Candida albicans
Budding yeast
Pseudohypha
Parent
yeast
cell
A
f
Germ tube
Hypha
Candida albicans
štúdium vlivu antibiotika nystatinu na morfológ plasmatické membrány
Blastomvces dermatitis