– Plasmidy – Integrace do genomu – Nadprodukce, delece – Tetrádová analýza – Syntetická letalita, suprese – Teplotně-sensitivní mutanty GENETIKA kvasinkové modely • Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C) • Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test => toxiny v plotnách – HU, MMS …) • Stabilní haploidní i diploidní formy • Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty) • Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) • Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní) • Centromerické a multicopy plasmidy • Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA) • Lze připravovat deleční a mutantní kmeny • Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“ • S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) • Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace) • EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid) Saccharomyces cerevisiae - oválné, množí se pučením – > diploidní i haploidní buňky - většina v G1 fázi (zatímco pombe je v G2 fázi) - Genom 12 Mbp na 16-ti chromosomech - Krátké centromery a ARS (100bp) - Kóduje cca 6 500 genů - 120 kopii rDNA (chr XII), 262 tRNA - Geny reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní) - <5% genů obsahuje introny (0.5% genomu), 3% transposony (46% u člověka) Schizosaccharomyces pombe - podlouhlé, množí se „polcením“ - většinou haploidní buňky - má blíž k vyšším eukaryotům (metazoa) - pouze 3 kondenzované chromozomy (13 Mbp) - velké repetitivní centromery (40-100kb) a 1kb počátky replikace - tvorba spindlu až v mitóze - asi 4800 kodujících genů (nejmeně u eukaryot) - z nichž 43% má introny - má geny pro heterochromatin, RNA interferenci (S.c. nemá) Chromosom III (nejmenší) CEN, ARS, TEL, Ty1-5 obsahuje MAT lokus Nomenklatura pro S.c.: YCRXXw: Y=yeast C= 3. chromosom R= pravé raménko XX=pořadové číslo w/c=Watson/Crick LEU2 – gen Leu2p - protein leu2∆ – delece leu2-1 – mutace (identifikační číslo alely) LEU2::HIS3 – inzerce genu HIS3 v lokusu genu LEU2 Nomenklatura pro S.p.: SPAXXXX: SP=S. pombe A= 1. chromosom … Forsburg: NRG, 2001 Baudat a Nicolas, PNAS, 1997 S. cerevisiae kompaktní genom Laboratorní kvasinkové kmeny S. pombe – „501“ Genotype: h- ura4-∆18 leu1-32 ade6-704 S. cerevisiae – „S288C“ – 1. osekvenovaný kmen Genotype: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1 Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C strains are gal2- and they do not use galactose anaerobically. References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43. Sources: ATCC:204508 „W303“ – nejčastěji používaný laboratorní kmen Genotype: MATa/MATα leu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 Notes: W303 also contains a bud4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns. In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele. References: W303 constructed by Rodney Rothstein Sources: Biosystems:YSC1058 Dvojhybridní systém: auxotrofie – využívána pro selekci Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference ade2-101 yes ochre mutation, red colonies G to T transversion at nucleotide 190, changing amino acid 64 from a Glu to a STOP Gai and Voytas, 2005 his3-200 no Cold sensitive; high frequency of petite formation, especially during transformation. 1 kb deletion, (-205 to 835) Struhl 1985; Fasullo and Davis 1988 leu2-3,112 no double mutant GTT-to-GCT missense change at codon 69, G insertion at nucleotide 249, G insertion at nucleotide 792, GAC-to-AAC missense change at codon 300. Hinnen et al. 1978; Gaber and Culbertson 1982; trp1-1 yes amber mutation GAG-to-TAG amber (STOP) nonsense change at codon 83 McDonald, et al. 1997 ura3-52 no - Ty1 insertion Rose and Winston 1984 Selekce Forsburg: NRG, 2001 - geneticin (G418) – podobný kanamycinu (mistranslace) - nourseothricin (NAT) – inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování (Streptomyces noursei), rezistence pomocí nat1 genu (N-acetyltransferasa – monoacetyluje NAT) - hygromycin B – inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin – interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus Shuttle vektory MET1 CUP1 MFA1 Methionin repressed Cu induced MATa specific (haploid specific) • bakteriální část – Kan resistence, replikace • kvasinková část - vychází z 2µm plasmidů nebo centromer (S.c.; 2µm přítomné také v Zygosaccharomyces bailii, Z. rouxii a Kluyveromyces drosophilarum) - CEN-ARS (1 kopie) nebo 2µm (~50 kopii na haploidní buňku) segregace (uchycení chromosomu) a začátek replikace • marker (URA3, NAT …), kvas. promotor, ORF (cDNA, optimalizovat), tag – indukovatelné, mutanty (fenotyp-funkce) • nadprodukce (suprese mutací, toxicita, biotechnologie) Sheng, Front in Microb, 2015FFA- free fatty acids, FAEE - fatty acid ethyl esters Příprava monomerů pro výrobu plastů – využití Candida tropicalis Lu et al., JACS (2010) • Candida tropicalis je schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku (acetyl-CoA) • mutantní kmen (∆POX4, ∆POX5) není schopen β-oxidace a přeměňuje je oxidací na di-karboxylové kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992) • pomocí flp rekombinasy odstranili geny oxidás (4 alkohol oxidásy) a dehydrogenás (6 alkohol dehydrogenás), aby eliminovali ω-oxidaci • nový kmen je schopen produkovat ω-hydroxymastné kyseliny, které lze použít pro výrobu bio-polymerů (plastů podobných polyetylenům, bio-odbouratelné na bio-palivo) • další modifikace kmene (integrace genů pro lipásy) by umožnilo přímé odbourávání odpadních olejů … integrativní plasmidy - nadprodukce - integrativní plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4 ) - exprese z AOX1 promotoru v P.pastoris - nemají CEN/2µm části Integrace I - integrativní plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4 ) - exprese z AOX1 promotoru - integrace do AOX1 lokusu - mechanismus homologní rekombinace Integrace II. - integrace do his4 lokusu mechanismus homologní rekombinace YAC (yeast artificial chromosome) • Bakteriální část – Amp resistence, počátek replikace • Kvasinková část – markery (TRP1, URA3), CEN4+ARS1, TEL • 50-500kbp insert např. lidská genová banka pro HuGO 80000 klonů YAC (270kbp) • Klonování, množení, uchování dlouhých fragmentů DNA • Výzkum savčích telomer a centromer • Pomocí transfekce, lipofekce nebo elektroporace lze dostat YAC i do savčích buněk – náhodně se integrují do genomu výzkum nesestřihnutých genů (dlouhé regulační úseky) Transformační protokol • Exponenciální kvasinková kultura • Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem • Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a přidat DNA (plasmidová/cirkulární i lineární DNA) • Přidat TE/LiAc/PEG4000 roztok • 30 minut na 30°C a poté teplotní šok při 42°C (15min) • Stočit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku • Rozetřít na selektivní plotnu Integrace: disrupce/delece genu - studium funkce genu – fenotyp (delece/mutace) - biotechnologie (přesměrování metabolických drah) - životaschopné - mutace lze přímo integrovat do genomu - esenciální gen - buňky potřebují gen např. na plasmidu (plasmid shuffling) 1. krok 2. krok neesenciální gen specifická mutace Využití inhibitoru FOA pro „odléčení“ URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3buňky jsou „rezistentní“) - opět ura-, takže URA3 marker lze znovu využít homologní rekombinace Esenciální geny - ne-esenciální gen – lze přímo deletovat/odstranit v genomu haploidní buňky - esenciální gen - Tetrádová analýza – ověření - plasmid shuffling - buňky potřebují funkční gen aspoň za určitých podmínek (kondicionální exprese) – další metody - hypomorfní mutanty - buňky potřebují aspoň „částečně“ funkční gen - ts mutanty - kondicionální mutanty URA3 x haploid haploid diploid kontrola bez uracilu + - +/další přednáška Delece genu - PCR - studium funkce genu – fenotyp - esenciální gen vs životaschopné - systematicky provedeno na všech ~6500 genech v rámci projektu EuroFan - kmeny lze získat z archivu EUROSCARF http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html Giaeveretal,Nature,2002 kanMX kanMX kanMX 1.PCR (barcode) 2.PCR (homologie) Kvasinkový ORF pro rekombinaci stačí pouze krátká homologie (50-100nt pro S.c.) specifické sekvence pro pozdější identifikaci a manipulace … PCR fragment genom EuroFan projekt - testy fenotypu Buněčná stěna (stabilizující) Oprava DNA Mikrotubuly (stabilizující) ts cs - Systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan - Funkční kategorie genů – anotace v databázích (genová ontologie) Mikrotubuly (destabilizující) Bun. stěna (destabilizující) Winzeler et al, Science, 1999; Giaever et al, Nature, 2002 ~ 6000 diploidních heterozygotních delečních kmenů ~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů) (neesenciální – pro růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy) - Testováno ~400 malých molekul a stresových podmínek (-aa ...) - Celkem provedeno ~ 6milionů testů - multidrug resistance (MDR) pokud byl gen potřebný pro resistenci vůči >20% z testovaných látek - Podobné profily svědčí o funkční podobnosti Hillenmeyer et al, Science, 2008 Geny/Proteiny peroxisomu Deleční knihovna – S. pombe - S. pombe potřebuje delší homologii (PCR = 80-350bp) - deleční knihovna od Bioneer (Korea, 25 000$) Kim et al, Nat Biotech (2010) - individuální vědecké studie … Delece genu pomocí transposonů Defekt buněčné stěny MacDonald et al.: Nature, 1999 esenciální Citlivé … - knihovna konstruktů s náhodnými integracemi Micheletal,eLife,2017 SAturated Transposon Analysis in Yeast (SATAY) - generováno 1.000.000 klonů – 300.000 inzercí (vysoké pokrytí na 6.000 genů) - cirkulární DNA použita pro NGS sekvenování (MiniDs transposon-specifické primery) - inzerce každých 40bp (preferenčně v nucleosom-free oblastech) - každý transposon sekvenován 20x … Michel et al, eLife, 2017 - inzerce chyběly v esenciálních genech (zelené šipky) - charakterizace GO, drug screening, syntetická letalita, … - rozlišení na úrovni domén (GAL10 – dvě domény z nichž esenciální je pouze první …) - C-koncové, ale i Nkoncové delece K integraci u kvasinek není nutný CRISPR - účinná homologní rekombinace - CRISPR zvyšuje účinnost integrace a nezanechává „stopy“ Horwitz et al, Cell Syst, 2015 Integrace: inzerce genu (CRISPR/Cas9) Torres-Garciaetal,WOR,2020 Rodriguez-Lopezetal,WOR,2017 sgRNA kazeta definuje místo štěpení donorová DNA nese HR integrační insert Horwitz et al, Cell Syst, 2015 Cas9 zaintegrován sgRNA kazeta definuje místo štěpení donorová DNA nese integrační insert Integrace: inzerce genu (CRISPR/Cas9) - CRISPR zvyšuje účinnost integrace a nezanechává „stopy“ Horwitz et al, Cell Syst, 2015 Phosphoenol pyruvate (glykolýza) 10 integrací do 3 lokusů (po dvou) syntéza kyseliny mukonové - bioplasty AroY v pěti kopiích – zvýšilo výtěžek delece ARO1 blokuje tvorbu aromatických AMK a vložené geny vedou k syntéze kys. mukonové – monomer pro bioplasty - sgRNA kazeta definuje místo štěpení - donorová DNA nese homologní integrační insert nová metabolická dráha lokusy: GAL80, HO, ARO1 AroB, D, F, Y a Z = E. coli CATA = C. albicans Životní cyklus S. cerevisiae - Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce - v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie zůstává nezměněná) - lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida - pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat jednotlivé haploidní buňky (lze provést i tzv. random sporulation) - u S.pombe jsou diploidní buňky nestálé a okamžitě sporulují (pouzdro se rozpadá samo) Životní cyklus S. cerevisiae - Deleci či mutaci lze provést v haploidní či diploidní buňce - v haploidní buňce hrozí suprese defektu proto je lépe používat diploidní buňky (druhá kopie zůstává nezměněná) - lze připravit dvojitého mutanta křížením haploidních mutant a poté sporulací diploida - delece esenciálního genu lze provést pouze v diploidní buňce (haploidní nepřežije) - po iniciaci sporulace dojde k meiotickému dělení (2n -> 4n -> 4x 1n) a vzniknou 4 haploidní buňky (lze rozdělit mikromanipulátorem – tetrádová analýza) Tetrádová analýza (S. pombe) spory přeneseny tenkou jehlou a rozmístěny v pravidelných odstupech YPD Tetrádová analýza 2 spory/kolonie normální + 2 spory/kolonie mutantní AAaa aaAA AaAa AaAa . . . A a YPD selektivní médium SD-ura Mendelův základní pokus s hrachem (diploidní) s kvasinkami (haploidní) URA3 x haploid haploid diploid kontrola bez uracilu s ade2 by byly červené + - +/- Genetické interakce - studium funkce genu – fenotyp - esenciální gen vs ne-esenciální (mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům“) - dále je lze křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy (epistase x syntetická letalita x suprese) Ab aB