Pozor změna termínů cvičení a testů (oproti 1. přednášce) Osnova 2. přednášky • Základní charakteristiky kvasinek – Taxonomie, evoluce – Podmínky růstu, růstové formy, sporulace … • Morfologie buněk, kolonií … sekrece – Amoniak – Aglutininy, flokulace – Adhesiny, invasiny – Killer toxiny • Diagnostické metody • Analytické metody Srovnání mikroorganismů Mikroskopické jednobuněčné organizmy … Saccharomyces cerevisiae: nadříše › Eukaryota říše › Fungi (houby) oddělení › Ascomycota (vřeckovýtrusé) pododdělení › Ascomycotina třída › (hemi) Ascomycetes řád › Saccharomycetales (kvasinkotvaré) čeleď › Saccharomycetaceae rod › Saccharomyces druh › Saccharomyces cerevisiaeLPS – lipopolysacharid, LTA – lipoteichoová kyselina PPM – fosfopeptidomannan, PLM - fosfolipomannan Bakterie Kvasinka Četnost v lidském mikrobiomu 99% <1% Velikost buňky 1um 10um Buněčná stěna peptidoglykan, LPS, LTA chitin, mannan (PPM, PLM), glukan pH 6,5-7,5 4,5-6,5 Teplota 10-80 20-30 Rezistence na antibiotika Ne Ano Přenos genetického materiálu Jádro Ano Ne Ne Ano Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do domény (nadříše) Eukaryota, říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy) - netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu (nemožné je jednotně definovat) - roztroušeny ve dvou odděleních hub: houby vřeckovýtrusné nebo stopkovýtrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - 1500 identifikovaných (odhad o několik řádů vyšší) wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Saccharomyces cerevisiae: nadříše › Eukaryota říše › Fungi (houby) oddělení › Ascomycota (vřeckovýtrusé) pododdělení › Ascomycotina třída › (hemi) Ascomycetes řád › Saccharomycetales (kvasinkotvaré) čeleď › Saccharomycetaceae rod › Saccharomyces druh › Saccharomyces cerevisiae („laboratorní kmen“) říše hub: pezizomycotina oddělení:pododdělení/třída: Kvasinky netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovýtrusé nebo stopkovýtrusé Ascomycotaodděleníbasidiomycota Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Cryptococcus neoformans Tremellomycetes Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes Dujon, TiG, 2006 Většina rodů využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes mezidruhová vzdálenost Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Xerotolerant Využívá laktozu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany Pivo Lidský patogen rody: Taxonomie kvasinek Basidiomycota Ascomycota Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata % odlišnost sekvence proteinů: – S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba – mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců – proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny, jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Přes velkou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomech Genomy (sekvence) kvasinek ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu se srovnávají těžko rozdíl mezi S.c. a S.p. je cca 300MYA Dujon, TiG, 2006 Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny volná voda (nikoli chemicky vázaná) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody – 0,95: Pseudomonas, Escherichia,…,většina bakterií – 0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) – 0,75: většina halofilních mikroorganismů – 0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) – 0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry Bakterie vyžadují vyšší hodnoty aw (víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa - lze takto potlačovat i bakteriální kontaminace v kvasinkových kulturách) Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku – (aw=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) – rostou přednostně v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), Lipomyces mají pouzdro – při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% NaCl Debaryomyces hensenii Podmínky růstu - kyslík - Většina kvasinek je obligatorně aerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytného pro syntézu některých esenciálních metabolitů – ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) - fermentativní typy (Saccharomyces c., S. p.) – pro fermentaci jsou vhodnější anaerobní podmínky, ale S.c. i v aerobních podmínkách fermentují - respirativní typy – převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu neprodukují ethanol) – rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis - teploty, při nichž mohou kvasinky růst: - mezofilní (0 – 48 °C) – většina druhů - psychrofilní (-2 – 20 °C) – voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus) - termofilní (ne méně než 20 °C) – potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) Maximální teploty, které (některé) kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. – rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C) Živiny • Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (některé jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulozu … nebo methanol (Pichia pastoris), alkany (Y. lipolytica) apod. • Nejpreferovanějším cukrem S.c. je glukóza (represe ostatních) • Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny Laboratorní podmínky: YPD/YES – bohaté médium = 10g/l yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/ S. pombe supplements: A, U, H, L, K Sabouraudův agar (1892) = 10g/l pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) – např. SD-L,T pro Y2H systém Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2SO4, 1g/l KHSO4, 0,5g/l MgSO4 x7H2O, 10g/l glukosa, 1ml/l Wickerhamův roztok, 20g/l agar Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) Forsburg and Rhind, Yeast, 2006 - Živiny ovlivňují morfologii/ buněčnou formu – kvasinková nebo houbová (pseudohyfy) nebo sporulace … - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami Sporulace/meiosa Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) CCM = complex colony morphology Kvasinková forma - morfologie - za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. - rotační elipsoid, kulaté, protáhlé – rod Dipodascus až 130 mikrometrů - 3-15 mikrometrů (bakterie30% buněk v populaci) LP = low penetrance (<30% buněk v populaci) Haylesetal.,OpenBiol,2013 Kvasinková forma - morfologie visualní analýza kvasinek deleční knihovny ~3500 kmenů (1. genome-wide) - např. delece genů regulujících buněčnou polaritu S. pombe způsobovaly oválný tvar buněk mikrotubuly buněčná stěna buněčná stěna a aktin krátké/tlusté morfologii kvasinek určují různé procesy: cytoskelet … (více v dalších přednáškách) Pseudohyfy … - při nedostatku dusíku se diploidní buňky protahují a vytváří pseudohyfy/hyfy – vrůstají do agaru - unipolární pučení, mateřské a dceřiné buňky zústávají spojené (úplná přepážka, neoddělí se dceřiné buňky x pravé hyfy mají přepážky průtočné) - na koncích (i mezi buňkami) mohou vznikat spory (blastospory), které se dále množí pučením (odlišení C. albicans od C. dubliniensis) - chlamydospory – kulaté, silnostěnné, na koncích nebo po stranách hyf – spory nevykazují tak vysokou odolnost jako u bakterii Candida albicans Spory C. dubliniensis: nadbytek chlamydospor na koncích krátkých pseudohyf C. albicans: na delších hyfách či pseudohyfách jen jedna terminální chlamydospora - haploidní spory vřeckovýtrusých kvasinek vzniklé při sporulaci diploidních buněk (pohlavní rozmnožování) Saccharomyces Schizosaccharomyces Lipomyces Hanensula Metschnikowia Nematospora - při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci meiosy a sporulace Sporulace - při nedostatku dusíku v kombinaci s ne-fermentovatelným uhlíkatým zdrojem dochází k indukci meiosy a sporulace http://www.genetics.org/content/suppl/2015/10/02/201.2.403.DC1 Hoffmann a spol, Genetics, 2015 - při vyčerpání živin na misce mohou (krajní) buňky začít meiotické dělení (diploidní S. cerevisiae) - meiosa je indukovana IME1 transkripčním faktorem (v ime1∆ se meiosa neindukuje vs. v pIME1 overexprimovaných buňkách je indukována meiosa i bez vyčerpání živin tj. 2% glukosa) ade2 (červená barva) ukazuje haploidizaci heterozygotního diploida (některé hapl. bílé vs červené) šipky ukazují vřecka se čtyřmi sporami rhomboedrické Purnapatre a Honigberg, Curr Genet, 2002 Spory - kolonie - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy“ kolonie – kulaté i oválné buňky (S.c.) – není určující faktor - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – většina - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) Kolonie Granek and Magwene, PLoS Genet (2010)cvičení Kolonie Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) - různé tvary kolonií: - hladké i „fluffy“ kolonie – kulaté i oválné buňky (S.c.) – není určující faktor - drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia) - slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces) - obvykle krémová barva – většina - červený pigment (Rhodotorula, Sporidiobolus) - černý pigment (melanin – Aureobasidium) - vliv živin na morfologii kolonie Např. odlišení C.d. od C.a.: 24h kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C (a) C. dubliniensis (b) C. albicans Morfologie kolonie - Candida - využívá se např. pro odlišení C.d. od C.a. (kultivace na Staibově agaru při teplotě 37°C) - tvrdý agar (4%, + suchá plotna) a UV záření indukuje „stopkování“ (složená z kvasinkových nikoli pseudohyfálních buněk) – zvyšuje šanci na diseminaci Engelbergaspol,JBacter,1998 S. pombe C. albicans S. cerevisiae - buňky v jamkách jsou chráněny před UV, zatímco ty na povrchu jsou zabity Čáp et al., Mol Cell, 2012 -větší buňky (4µm) -malé mitochondrie a vakuoly -více lipidových váčků rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů -menší buňky (3µm) -velké mitochondrie i vakuoly (aktivnější respirace a více ROS) kolonie Čáp et al., Mol Cell, 2012 rozdíly jsou patrné i na expresní úrovni proteinů Differenciace S.cerevisiae v kolonii Čáp et al., Mol Cell, 2012 U (upper) buňky - aktivní glutaminem-indukovanou TOR dráhu, sníženou respiraci (málo mitochondrii), AMK-sensing systém (Gcn4) a vyšší „turnover“ AMK (souvisí s produkcí amoniaku), produkují amoniak pro komunikaci kolonii - využívají živiny uvolněné z L buněk (autofagie) - jsou odolnější vůči stresu – déle přežijí - schopné proliferovat (po 10 dnech) L (lower) buňky – podléhají více stresu, hladoví (přestože jsou blíže mediu), aktivují degradační mechanismy (zásobují U buňky) Kvasinkové kolonie spolu „komunikují“ (i bez dotyku) pomocí amoniaku – inhibuje růst sousední kolonie (kolonie S. cerevisiae produkují amoniak po 10 dnech růstu) Pálková et al., Nature 390 (1997) kolonie přesměrovává růst sousední kolonie – nekompetují o živiny Aktivní inhibice růstu sousední kolonie nikoli (pasivní) důsledek spotřebování živiny Komunikace kolonií - tvořen EC matrix s mikrokoloniemi kvasinek, hyfami a pseudohyfami (komplexní struktura) - více rezistentní než planktonické buňky - významně přispívá k rozvoji a odolnosti kandidóz (rezistentní k antimykotickým látkám) - ECM a adhesiny/flokuliny FLO1, FLO11 jsou potřebné pro tvorbu biofilmu - váží např. peptidy na povrchu hostitelské buňky (C. albicans = ALS2, 3, 6, 7, 9 exprimovány při vaginální infekci zatímco ALS1, 2, 3, 4, 5, 9 exprimovány při orální infekci) Biofilmrůzné vývojové programy (formy) vedou k mnoho-buněčným strukturám - tvorba biofilmu na pevném podkladu se sníženým množstvím agaru (málo glukozy) Extracelularní matrix Stovicek et al, Fungal Gen Biol (2010) - morfologie kolonie závisí na ECM (extracellular matrix tj. glykoproteiny) - ECM zachycuje vodu a chrání kolonii před vyschnutím - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (… biofilm, flokulace) - závisí na FLO11 (adhesin – glykoprotein – faktor důležitý pro flokulaci, biofilm, pseudohyfy) ECM Laboratorní kmeny jsou hladké (např. S288C - Genotyp: MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1) Ryan et al, Science (2012) - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (invasivní růst, pseudohyfy, biofilm, flokulace) - FLO11 = adhesin (glykoprotein – faktor důležitý pro uchycení) - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Flo11, Flo8, Mfg1 faktory jsou konzervovány … a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans S.c. kmen Σ1278b Invasivní růst Ryan et al, Science (2012) - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FLO11 = adhesin (glykoprotein – faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (… biofilm, flokulace) adhesin Flokulace - reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky); odpověď na stres - flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci piva) Smukalla a kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky … - Flo1p váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci – teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování - Více v další přednášce Yeast surface display - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 …) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy … posttranslační modifikace) – knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie – vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Pepper et al, CCHTS (2008) aglutinin - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) YSD - testy antigen/protilátka Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) - v kvasince je exprimována knihovna (např. IgG klonů) – na kuličkách je navázán antigen (fluorescenčně značený) – opakováním vychytávání dojde k nabohacení (i slabších interakcí) množením se nabohatí - zopakovat sorting Kvasinky C. albicans jsou schopny se přichytit k epiteliálním buňkám hostitele (pomocí adhesinů – Hwp1) – invasiny (Als3 a Ssa3 mohou interagovat s receptory) se podílí na vnoření pseudohyfy do buněčné membrány hostitele – Ece1 je rozštěpen Kex2/Kex1 proteasami na peptidy (Golgi), které jsou sekretovány a vytváří (peptid III) póry v cytoplasmatické membráně (jako bakteriální toxiny) Mitchell, Nature, 2016; Moyes et al., Nature, 2016; Los et al, MMBR, 2013 Pseudohyfy, adhesiny … a candidalysin Killer toxiny - Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře – nepřerostou je cizorodé kmeny) - Poprvé analyzováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) - Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (preprotoxin …) - Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles“ (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) – kódují obalové, replikační proteiny (ale potřebují buňku k replikaci …), transkripční sekvence a toxin - Samotné VLP nejsou infekční (nejsou uvolňovány z buněk - lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) ani toxické (preprotoxin v původní buňce interaguje/inaktivuje maturovane/sekretované toxiny) - Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (β-1,6-glukany) způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně – ztráta iontů, potenciálu … buňka hyne - Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens – lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) - Hansenula mrakii … - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu β-1,3glukanu (v místě růstu pupenu) - Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena Pichií membranifaciens - Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci – odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) - v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny C.a., C. podzolicus zabíjí C.n.) Santos et al., 2009, Microbiology Určení (nových) kmenů v nových lokalitách Určení kmene v klinických izolátech (odlišení patogenních kmenů Candida…) Kontrola čistoty kmene pro biotechnologické procesy (Saccharomyces cerevisiae – pivo) zpracování vzorků: z půdy: promývání v destilované vodě → homogenizace → třepačka … klinické vzorky: tělní tekutiny, stěr nebo pomocí lepivé pásky … a pak vysetí na Sabouraudův agar nebo bohaté médium → kultivace 2-7 dní při teplotách 22-42°C (37°C) identifikace/analýza: - fenotypové metody – morfologie kolonií, morfologie buněk (…spor) - biochemické vlastnosti (fermentace cukrů, asimilace uhlíkatých nebo dusíkatých substrátů … růst na chromogenních plotnách) moderní metody - PCR (nested, multiplex, RFLP), - sekvenační (NGS technologie), - hmotnostní spektrometrie Lékařská mykologie – Bi3390 V klinické praxi je důležitější rychlost než přesnost (při zachování správné léčby) http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych- moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847 doc. P. Hamal, UP Olomouc - souprava Iatron Serological Candida Check Kit (Iatron Laboratories) nebo Bichro-latex Albicans (Fumouze Diagnostics) Sérologické testy Latexová aglutinace C. dubliniensis C. albicans Teplotní test Totéž platí pro kvasinky Specifické protilátky proti antigenům buněčné stěny kvasinky latexové částice Chromogenní testy - test enzymových aktivit - chromogenní substráty – např. tetrazoliové soli Cakr Cagl Caal Catr tetrazoliová sůl redukce * ** * * Příklad analýzy: CANDIchrom – chromogenni metoda (enzymatická přeměna tetrazoliové soli) 1-2 dny *ELITex – latexové aglutinační metody (protilátky) 5 minut *ELIchrom – biochemický test (aktivita trehalasy) 20 minut ELIchromFUNGI – biochemické testy 1-2 dny Candida, Saccharomyces, Rhodotorula, Cryptococcus, Trichosporon, Geotrichum, Kloeckera, Pichia Biochemické testy - Biochemické parametry – založeny na schopnosti utilizace uhlíkatých látek (cukrů), přeměnit dusíkaté látky (hydrolýza močoviny - ureasa) - Tato schopnost se odvíjí od metabolických schopností daného druhu – přítomnosti specifických enzymů (především dehydrogenas, fosfatás, βglukosidáza, β-N-acetylhexosaminidázy) (např. C. dubliniensis není schopna utilizovat D-xylózu, D-trehalózu, methyl-α-D-glukosid –chybí β-D-glukosidázová aktivita; C. albicans není schopna utilizovat glycerol) hundreds A.J. Kluyver – počátek 20. stol. Je možné určit až 267 druhů kvasinek z 53 rodů (ale pouze 50% spolehlivost) nárust kvasinek Molekulární taxonomie - konvenční taxonomie je problematická : - morfologie kvasinek není stabilní→ roztěr a nárůst trvá několik dní (prodlužuje se včasná diagnóza …) – - molekulární taxonomie (komerční účely - odlišit kmeny S.c.) - pulsní gelová elektroforéza (PFGE), FISH (karyotyp) - PCR, restrikční polymorfismus (odlišení druhů) - nejnověji MALDI-TOF (taxonomie) - většinu morfologických nebo enzymatických … charakteristik lze zvrátit mutací (v jediném genu) - obtížná izolace DNA, proteinů … z kvasinek - je třeba nejdříve narušit silnou buněčnou stěnu … pomocí enzymů nebo mechanicky - poté PFGE nebo dále extrahovat DNA (např. fenol-chloroform, poté srážení etanolem) - specifické sekvence lze identifikovat pomocí Southern blotu nebo PCR - izolace DNA a štěpení restrikční endonukleázou -> agarozový gel -> přesátí na membránu -> sonda značená digoxigeninem (většinou se využívá sekvencí rDNA) Identifikace založená na odlišnosti typických sekvencí DNA Nested („zahnízděná“) PCR • amplifikace probíhá dvoufázově • v 1. fázi je pomocí jedné sady primerů (kvasinkové) namnožena delší sekvence nukleové kyseliny • takto získané amplikony jsou pak přeneseny do jiné amplifikační zkumavky obsahující druhou dvojici primerů (druhová), specifických k vnitřní oblasti úseku amplikonů • konzervovaná intergenová oblast rDNA • detekce gelovou elektroforézou • eventuálně sekvenace Romeo et al., J. Microbiol Met 79 (2009) univerzální primer (konzervativní oblast 5.8S rDNA) Candida glabrata 397bp Candida nivariensis 293bp Candida bracarensis 223bp Multiplex PCR • amplifikace se směsí primerů (jeden univerzální, další specifické) Studie populací S. cerevisiae • NGS sekvenace > 100 kmenů z různých koutů světa a různých biotechnologií • (SNPs) ukazují na geografickou závislost Gallone et al, Cell, 2016 pivní linie ve VB, US, Belgii … a další linie č.2 sake v Asii (i bioetanol v Číně) mixed - specifické silné belgické ales (refermentace v lahvích) - chleba Gallone et al, Cell, 2016 spirits – netvoří jednu linii (nepoužívají se opakovaně – není selektivní tlak – moderní technologie) S. paradoxus outgroup americké pivo má kořeny v Británii •pivo 1 a 2 - nové pivní linie (evolučně izolované –– 2 domestikační události - linie 2 domestikace s vinnými kmeny) - (geny podílející se na C a N metabolismu, flokulaci … mají nejvíce (CNV – copy number) variací) Mosaikové kmeny analýza genomu a fenomu: průmyslově-specifická selekce na toleranci ke stresu (vyšší obsah etanolu 7-15%), využití cukru, specifické aroma, nižší schopnost reprodukce „očkováním“ předchozích pivních kultur do nových kvasných procesů (ztráta kontaktu s přirodním prostředím - ~75 000 generací) – např. ztráta schopnosti sporulovat (stále bohaté médium), rychlejší evoluce … nebo naopak zvýšení resistence vůči sulfátům (přidávaným kvůli konzervaci) mutace a duplikace v MAL genech – zlepšení schopnosti utilizace maltosy - nonsense mutace PAD1 a FDC1 (snížení produkce 4-vinyl guaiacolu odpovídajícího za nepříjemné aroma piva) … Gallone et al, Cell, 2016 vznik klášterních pivovarů nejvíce amplifikací v MAL genech (IMA2, IMA3, MAL31, MAL33, MAL32) u pivních kvasinek (rostou na maltose), zatímco ve vinných kmenech došlo k mnoha delecím těchto genů (ve vinném moštu maltosa není) – obecně více delecí než amplifikací (v genomech analyzovaných kvasinek) Gallone et al, Cell, 2016 analýza genomu hierarchické členění výsledků analýzy fenotypu (fenomu) – určitá korelace s genomem … - pivní linie (beer1) nejsou příliš odolné vůči stresu (nejsou mu vystaveny v pivovarech), zatímco vinné kvasinky jsou velice odolné (kvasné prostředí je bohaté na cukry a vyšší koncentrace alkoholu – hladina cukrů se v různých sezónách liší … mimo sezonu přežívají v „přírodním“ prostředí – musí být adaptabilnější než pivní) Gallone et al, Cell, 2016 analýza fenomu víno pivo • hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry– MALDI-TOF) • Umožňuje odpaření a ionizaci netěkavých biologických vzorků z pevné fáze přímo do plynné • Vzorek je smíchán s tzv. matricí, směs se nanese na speciální kovovou destičku a nechá zaschnout • Destička se vloží do iontového zdroje a ve vakuu je ozářena pulsním laserem (UV) • Energii laserového pulsu absorbuje matrice a předá ji molekulám analytu – odpaří se • ion vstupuje do vakua v trubici detektoru - z jeho pohybu vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr jeho hmotnosti a náboje (z doby letu částice) MALDI-TOF • Charakter spektra závisí na krystalizaci a ionizačních vlastnostech vzorku  výška píku je rovna relativní koncentraci proteinu v místě ionizace • Při srovnávání spekter druhů uvnitř rodu se hledají rodově charakteristické signály píků • Identifikace na úroveň kmenů možná díky detekci charakteristických proteinů a peptidů Qian a spol, Anal Bioanal Chem, 2008 MALDI-TOF Konecna a spol, JAFC, 2012 Proteiny v pivu Stříbrem barvený 2D gel Rostliny a kvasinky - především na kazících se plodech - na spadlých rozkládajících se plodech (vinná réva, agave …) - tequila, mezcal, bacanora, raicilla Gallegos-Casillas et al, Yeast, 2023 Opathy, C., Gabaldón, T. (2019). Recent trends in molecular diagnostics of yeast infections: from PCR to NGS, FEMS Microbiology Reviews, 43 (5), 517–547. doi: 10.1093/femsre/fuz015