Test: 5.12., C02-2.11 - psací potřeby (A,B,C,D)
Zkouška/prezentace:
5.12. od 9.00, C02-2.11 (max 7 studentů)
?? a termíny v lednu …
Kvasinky … může být oblast vaší DP (ne samotná DP)
- úvod do problematiky
- výsledky z článku (ne starší než 5 let)
- závěry, reference
přednáška 15 + 5 minut
Cvičení: 12. a 13.12. od 8.00, B07-2.17 - pláště, psací a
kreslící potřeby
• Párování kvasinek
– Fyziologie
– Regulační dráhy
– Přepínání párovacího typu
– Regulace transkripce specifických genů
• Regulace transkripce
– Gal4 transkripční faktor
• Hybridní systémy
– transkripční hybridní systémy
– alternativní kvasinkové hybridní systémy
(vycházející z poznatků o kvasinkách)
Párování/mating kvasinkových buněk
G1-A
G1-B G1
- haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují
- S. cerevisiae = a/alfa, S. pombe = h+/h-
vytváří diploidní buňky (S. cerevisiae = stabilní, S. pombe = okamžitě
sporulují)
- párování doprovázeno zásadními změnami v morfologii
Merlinietal,OpenBiol,2013
STE = sterile
lokalizovanátranslace
Geny/proteiny …
- specifické pro a/α (receptor …)
- haploidní (specificky iniciovaná dráha…)
- obecné (haploidní, diploidní …)
cvičení
Chromosom III obsahuje:
- MAT lokus
- MAT a (HMR) kazeta
- MAT α (HML) kazeta
HML a HMR jsou tiché
alely (heterochromatin)
Co a1, a2 + α1, α2
kódují? (transkripční
faktory)
HO endonukleasa –
výměna kazet v MAT
lokusu (rozeznává
specifické sekvence)
Heterothalické – stabilní
Homothalické – přepínají
párovací typ
Chromosom III
Regulace transkripce v haploidních buňkách
(konstitutivní)
a1, a2 + α1, α2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (α-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
α-spec.= MFα1,2 (α-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy), HO …
aSG ON
αSG OFF
haploid SG ON
MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem
a haploida1, a2
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
diploidα1, α2
a1, a2
aSG OFF
αSG OFF
haploid SG OFF
α2
α1
α2a1
Lee a Haber, Microbiol Spect, 2015
MET1
CUP1
MFA1
Methionin repressed
Cu induced
MATa specific (haploid specific)
α haploid
aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
Struktura promotorů
Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky
netranskribují z takových promotorů – kvasinkové plasmidy …)
- Většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu
(specifické pro kvasinky)
- TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu
boxu u bakterii)
- UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences)
- DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu)
Represor
na URS
Aktivátor
na UAS
konstitutivní
Regulace metabolické dráhy galaktózy
Gal2 Gal1 Gal7 Gal5
Gal10
- pouze GAL5 gen je konstitutivně exprimován (potřebný pro metabolismus glukózy)
- GAL4 gen kóduje transkripční faktor (aktivátor), který se váže na UAS GAL1, GAL7,
GAL10, GAL2 …
název GAL
podle screenu mutanty
neschopné
utilizace galaktosy
(vyřazení jednoho
genu znemožní
kvasince
metabolismus)
GAL4 gen kóduje transkripční faktor
(aktivátor), který se váže na UAS GAL1,
GAL7, GAL10 …
Regulace metabolické dráhy galaktózy
Hittingeretal.,PNAS,2004
Johnston,MMBR,1987
Ren et al., Science, 2000
ChIP Gal4p
microarray po galaktose
Fur4p zvyšuje množství uracilu pro UDP-Gal
Mth1p potlačuje transport glukosy (zlepšuje příjem gal)
Pcl10p potlačuje glyconeogenezi (maximalizuje zisk z gal)
Gal80p inhibuje/blokuje Gal4p
/GAL5
Johnston et al., MCB, 1994
- glukosa reprimuje transkripci GAL genů na různých úrovních
- URS v promotorech GAL1 genu (Mig1 represor) - reprimuje transaktivaci
GAL4 transkripčním aktivátorem
- Gal80 blokuje Gal4 aktivační doménu
- reprimuje GAL3 induktor a GAL2 permeasu
aktivátor
inhibitor Gal4p
induktor
Regulace transkripce GAL genů
Chr. II Mig1
represor
Rozdíly v utilizaci galaktózy
Hittingeretal.,PNAS,2004
- různé kvasinky využívají různe cukry (viz přednáška o určování kvasinek)
- S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus, S. castellii, S. kluyveri, a
K. lactis využívají galaktosu – mají všechny GAL geny
- S. kudriavzevii, C. glabrata, K. waltii, a E. gossypii nemohou využívat galaktosu
(GAL geny jim chybí – úplná ztráta – nebo je mají nefunkční = psudogeny)
evolucepříště
Transkripční aktivátor Gal4p
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Vznik 1-hybridních systémů
- Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast)
pro testování mutantních p53 (transkripční faktor)
Různé transkripční faktory mají DBD a AD domény a lze je kombinovat …
Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny)
Grochová et al., Oncology Reports, 2008
mut p53 (duplikace 30bp)
kvasinka opravila
Ade2 reporter genUAS
transkripcep53
wt
Ade2 reporter genUAS
p53
mut
- stanovení aberací p53 v klinickém materiálu - imunoanalýza, FISH, sekvenace
- určení funkčního statutu - stanovení transaktivačích schopností p53 metodou
FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast) - stanovení
transaktivačních vlastností p53 prostřednictvím speciálně upraveného
kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae yIG397
Analýza funkčních vlastností p53
Grochová et al., Oncogene, 2008
test teplotní sensitivity
test promotorů
luciferáza
D-luciferin + O2 oxyluciferin + světlo
Toxikologické aplikace
RECETOX/CETOCEON
(Dr. Čupr/prof. Holoubek)
Bartos et al, Env Tox, 2006
V tomto systému byly
testovány různé polutanty –
efekt na „estrogenní“ dráhu
Dvoj-hybridní systém
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
BD a AD domény lze zaměnit
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2)
velmi citlivý (3AT)
velmi stringetní
semikvanitativní (β-gal)
Gal4 systém
různé promotory
Klasický Y2H systém
Nejčastěji používaný kmen PJ69-4a/α
kvantitativní
auxotrofie
(media bez …)
FACSorting
rezistence
(media s aureobasidinem)
Reportérové geny
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
2-hybridní systém
His3
His3
His3
Uetz et al., Nature, 2000
Y
X
DBD
AD
Mat a buňky
8x12 jamek
(96 na misku)
Všechny ORF
Mat α buňky
Y
X
Reporter genGAL1 UAS
transkripceDBD
AD
Kvasinkový „INTERACTOME“
Místo transformací dvou plasmidů do
jedné buňky byly BD plasmidy v α
buňkách a AD v a buňkách –
párováním byly vytvořeny jejich
kombinace
vs bakter, savčí
Protein
„networks“
RNA sestřih
• „high-throughput“ screen - interaktom
S. cerevisiae >30 000 interakcí (~6000
proteinů)
• pomocí Y2H podobný „highthroughput“
screen pro lidské a jiné
proteiny …
Network/síť naznačuje funkční vztahy
Tucker et al, TiCB, 2001
Reversní systém (Y2H)
- při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou
kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě
kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374
Split-hybrid systém
Shih et al, PNAS, 1996
represor
bez represoru
Klasický dvoj-hybridní systém
Troj-komponentní (dvoj-H) systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Dvoj-hybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Troj-hybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor
Hybridní RNA molekula
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein)
2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2
sekvence
3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR)
Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
Licitra et al, PNAS, 1996
dexamethasone
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a glukokortikoid receptor
(váže dexamethason)
2. Organická sloučeniná obsahující
dexamethason a FK506 (v médiu)
3. AD-Gal4 a FKBP12 (váže FK506)
CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje
RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý
(interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě)
Broder et al, Cur Biol, 1998
Bruckner et al, IJMS, 2009
Přehled kvasinkových PPI biotechnologií