Protoplasty kvasinek jako modelový objekt Historie objevu modelu protoplastů Metody přípravy protoplastů Metody regenerace buněčné stěny u protoplastů Fúze protoplastů Sexuální hybridizace u protoplastů Genetická transformace kvasinek na modelu protoplastů Lýza buňkové stěny/mechanické protržení Rostlinná buňka Protržení buňkové stěny Protoplasty jsou buňky s odstraněnou buňkovou stěnou, cytoplasmatická membrána je vnější vrstva buňky Historie objevu • Hanstein 1880: Protoplast jako živoucí hmota obklopená buněčnou membránou • Protoplasty rostlinných buněk (Klebs 1887,Townsend 1897) • Sféroplasty, L-formy a protoplasty bakterií (Weibull 1953, Dienes 1939, Kandler, 1954) • O.Nečas a plasmatické koule kvasinek (Nečas, Chekhoslovatskaia Biol 1954) • Autolytické protoplasty (O. Nečas, Nature 1956) • Protoplasty kvasinek připravené lýzou b. stěny, Helix pomatia – šnekáza (Eddy a Williamson,1959) • Regenerace protoplastů v gelech (Nečas, 1962, A. Svoboda 1966) Metody přípravy protoplastů • Mechanické rozbití kvasinkových buněk v hypertonickém roztoku • Autolýza buněčné stěny • Aplikace enzymů lyzujících buněčnou stěnu – Výběr osmotika - sorbitol, manitol, KCl, MgSO4 a koncentrace – Aplikace látek rušících S-S vazby v buněčné stěně – merkaptoetanol, dithiothreitol Buňky kvasinky Saccharomyces cerevisiae a čerstvě vytvořené protoplasty Trigonopsis variabilis Protoplasty S. cerevisiae ve fázovém kontrastu (3a) a po lýze v destilované vodě – pokovený preparát v elektronovém mikroskopu (3) Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes (Grubb et al. 2015) Růst protoplastů v tekutém mediu nebo na povrchu agarových bločků: jádra se dělí, cytoplasma vytváří vakuolizované útvary. Regenerace buněčné stěny na povrchu protoplastů při kultivaci v tekutém mediu a v gelu Morfologie regenerace protoplastů v 2% agarovém gelu Tvar rostoucího protoplastu není určován regenerující buněčnou stěnou, ta jen modifikuje morfologii rozpínající se cytoplasmy Regenerace protoplastů v polyethylenglykolovém mediu Fúze protoplastů je fyzikální fenomén, při kterém dochází k fúzi dvou a vícero protoplastů během jejich vzájemném blízkém kontaktu (náhodném nebo indukovaném) Indukovaná fúze: Mechanická fúze – mikromanipulátor Chemofúze: dusičnan sodný, PEG, Ca2+ ionty, způsobují adherenci protoplastů nespecifická, levná, ale cytotoxická může vytvářet masivní fúzní produkty Elektrofúze elektrická stimulace elektrické pole se slabou sílou (1-5 kV/cm) kontrolovatelná, reprodukovatelná méňe toxická, ale drahá Optimalizace fúze protoplastů (a) Nízká koncentrace PEG způsobuje prasknutí protoplastů (b) Vysoká koncentrace způsobuje nadměrné shlukování Aglutinace protoplastů ve 40% polyethylenglykolu a vytváření polyprotoplastů po zředění živným mediem Elektrofúze Střídavý proud Povrchy agregovaných protoplastů ve 40% PEG Lokální poruchy struktury plasmatické membrány po inkubaci protoplastů ve 40% PEG 30 min při 370 C Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Aspergillus fumigatus Protoplasts Rizzo et al. 2020 Bílá šipka = extrabuněčné vezikuly Žlutá šipka = fibrilární struktury obnovující buněčnou stenu Skenovací elektronová mikroskopie Aplikace protoplastů kvasinek v buněčné biologii a genetice • Studium funkce buněčné stěny mechanická bariéra signální funkce – recepce stresových faktorů, feromonů aj regenerační schopnosti buňky syntéza komponent buněčné stěny • Studium struktury plasmatické membrány • Studium nepohlavní hybridizace kvasinek vnitrodruhová a mezidruhová hybridizace • Transformace kvasinek Protoplasty S.c. α + a, pouze neorientovaný růst, žádná fuze α protoplasty + a buňky: párovací výběžky tvoří pouze buňky Orientovaný růst buněk směrem k rostoucímu protoplastu – žádná fuze Protoplasty opačných párovacích typů fúzují teprve tehdy, zregenerují-li svoji buněčnou stěnu Využití fúze protoplastů Fúze protoplastů mezi Saccharomyces cerevisiae var. Diastaticus a S. bayanus/uvarum vedla k vzniku klonů produkujících pivo s nízkým obsahem cukru a zajímavé vůně. (Saccharo (cukr) myces (houby) cerevisiae (pivo)) Hybridní klony – produkce glycerolu (kvalita vína), tolerance nízkých teplot (řízená fermentace – lepší macerace vín), osmotolerance, metabolizmus kyseliny jablečné, produkce vonných esterů, biopaliv, fermentace xylózy Torulaspora delbrueckii diploidní kmen byl vytvořen pro průmyslové fermentační aplikace. Polyploidní kvasinky – tolerance vyšší teploty, robustní fermentace, tolerance vyššího obsahu alkoholu Produkce cybridů – přenos dsRNA plazmidu nesoucího killer toxin do kvasinek pro řízenou fermentaci => omezení růstu divokých kvasinek => využití při řízené fermentaci při produkci vína či piva Mezidruhová fuze S.cerevisiae his- x S.pombe trp- :tyto druhy jsou fylogeneticky vzdálené, S. cerevisiae má 16 chromosomů, S. pombe pouze 3. Protoplasty mohou fúzovat, v minimálním agaru i rostou, na hybridní buňky však nerevertují Produkce mezidruhových cybridů (přenos mitochondrií/mtDNA) Fluoroorotová kyselina Selekce ura- genu ura- gen Ura+ gen Fylogenetický strom -D1/D2 doména 26S rRNA genu MtDNA donorů mitochondrií a cybridů štěpen EcoRV restrikčním enzymem donor cybrid akceptor Pulzní elektroforéza chromozomů akceptor donory cybridy Cybridy s mtDNA blízkých druhů Cybridy s mtDNA vzdálených druhů Růst v médiu s nefermentovatelným substrátem Protoplasty zprostředkovaná transformace Příprava protoplastů, odstranění buňkové steny (polysacharidy - glukan, manan, chitin), složení je dynamické, různé složení u odlišných kvasinek => optimální výběr enzymů (šnekáza, Zymolyáza, Lyticase, beta-glucanase a pectinase z Trichoderma sp. a Aspergillus niger), lýza probíhá v pufru obsahujícím osmotický stabilizátor (např. 0,8-1,2 M sorbitol) Transformační roztok dále obsahuje DNA, Ca2+ ionty (otvírá kanály v cytomembráně a PEG (fúze protoplastů), inkubace na lede 30 minut regenerace protoplastů na miskách bez selekčního tlaku Alternativně DNA může být vnesena do lipozomú (Dioleoylphosphatidyl ethanolamine (DOPE) or dioleoylphosphatidyl choline (DOPC))