Test 1• testy předat příště přednášejícímu nebo zaslat na E-mail: jpalecek@sci.muni.cz
• 1. Jaké typy AMK se nejčastěji podílejí na protein-proteinových interakcích?
• a. polární
• b. nabité
• c. hydrofobní
• d. aromatické
•
• 2. Jaké sekundární struktury se podílí na coiled-coil vazbě?
• a. beta-listy
• b. beta-listy a šroubovice
• c. smyčky
• d. vzájemně se obtáčející šroubovice
•
• 3. interaktom je:
• a. interakční síť proteinů (pro daný organismus)
• b. soubor všech interakcí jednoho proteinu
• c. databáze všech interakcí molekul
• d. interakce podílející se na vzniku komplexů
• 4. Jaké charakteristiky musí splňovat povrchy vzájemně interagujících proteinů?
• a. stačí, když mají opačné náboje
• b. stačí, když mají komplementární tvary
• c. musí mít komplementární charakter (tvar, polaritu)
• d. stačí, když jsou hydrofobní
• 5. napište aspoň 2 příklady proteinů s coiled-coil doménou:
Test 2• 6. Co je to komplexom?
• a. interakční síť proteinů v buňce
• b. soubor všech interakcí jednoho proteinu
• c. soubor proteinových komplexů v buňce
• d. síť silných interakcí
• 7. Jak může post-translační modifikace proteinu přímým způsobem ovlivnit protein-proteinovou interakci?
• a. nemůže ji ovlivnit
• b. ovlivní pouze konformaci proteinu
• c. blokuje nebo posílí vazbu
• d. degraduje protein
• 8. Jaké hlavní výhody skýtá proteinový komplex složený z podjednotek (oproti stejně velké makromolekule
obsahující pouze jeden protein)?
• a. lepší dynamika, modularita, regulace
• b. větší stabilita proteinů
• c. lepší přístup k proteinům
• d. účinnější převod regulačních signálů
• 9. Jak pracuje mitochondriální ATP pumpa při konverzi ADP na ATP?
• a. transportuje přes membránu Na+
• b. využívá molekulu cGMP
• c. transportuje K+ přes membránu
• d. generuje rotační pohyb při transportu H+ přes membránu
• 10. napište aspoň 2 příklady molekulárních strojů:
•
•
•
• Proteinové interakce – 29.10.
– jak spolu proteiny interagují?
– interaktom
• Proteinové komplexy – 5.11.
– protein-proteinové interakce a komplexy
– příklady komplexů (ATPase, PCNA …)
– komplexom, skládání komplexů
CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
PROTEOMIKA
Připomenutí - protein-proteinové interakce
+
polá
hydrofob
rní
ní
primární
struktura
sekundární a terciární struktura
- proteiny/domény/motivy interagují s proteinovými partnery
– domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar
jejího povrchu, ale …
– charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postranní
řetězce aminokyselin směřujících do solventu …
– interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i
charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …)
- proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén => mají více
vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“
coiled-coil
Protein-proteinové interakce
• stabilní/silné (velké plochy, většinou součástí komplexů)
• přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání
signálů, modifikace)
• posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti
povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO)
• souhrn proteinových interakcí = interaktom
(modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén
- různé „(re-)wiring“ komplexů)
interaktom
komplex
Baderetal,FEBSLett,2008
Baderetal,FEBSLett,2008
modulace interakcí – inhibice vs nové interakce (virovými proteiny, mutacemi)
Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů )
Síť neznamená komplex
(hůře popisuje stabilní
komplexy, ale lépe
popisuje vztahy)
protein X posílí vazby =
komplex
protein Y inhibuje vazbu
(C1-B3, H-B3)
NSE1
NSE1
NSE4
NSE4
-L,-T,-H
-L,-T
vect
WT
L264F
P209L
patients
L97A
F266A
NSE3
L264F
P209L
WT
WT
NSE3
NSE3
vanCrabbenetal,JClinInvest,2016
narušení interakce dvou podjednotek (Nse3-Nse4) vede k nestabilitě celého komplexu
… kvarterní struktura
Sergeant et al.: MCB, 2005
- více povrchů jednoho proteinu interaguje s více partnery
- vzájemné interakce více proteinů vytváří větší povrchy a
vzájemně se stabilizují – vzniká pevný (kvarterní) komplex
Nse4
- vazba NSE3-NSE4 pomáhá navázání NSE1 na NSE4
Liljas a spol.
ATPasová pumpa komplex
se stálým
složením/poměrem
podjednotek („neměnný“)
Stabilní komplex – molekulární stroj
PDB: 1C17:Apumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu
Rastogi & Girvin, Nature, 1999
podjednotka a obsahuje arginin, který předává
proton/vodík aspartátu - dochází k neutralizaci
náboje – otočka.
F0 je protonový rotor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových
iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu – dva tunely v podjednotce a
(přivádí a odvádí protony)
Hahn et al., Science, 2018
Při otočce osa tlačí na F1 stator (3 různé konformace)
– levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP
- pravý panel = ATP molekula byla vytlačena
rotor je osou spojen se statorem vyrábějícím ATP (nebo poháněným ATP ).
Hahn et al., Science, 2018
Hahn et al., Science, 2018
14.4-ATP_synthase – učebnice: Alberts a spol, Molekulární biologie buňky.
„ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to molekulární motor –
„nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie). ATP moduluje interakce proteinů
https://www.youtube.com/watch?v=CN2XOe_c0iM
Mulkidjanian et al, NRM, 2007
- ATPasové pumpy …
- sekreční systém (T3SS injectisom)
- pohon bičíků …
•Rotační motory:
• FoF1-ATPsyntása/ATPasa – přeměna elektrochemického potenciául na
energii ATP (mitochondrie) – nebo naopak energie ATP k pumpování
protonů přes membránu (vakuoly)
• rotace bakteriálních bičíků
•Cytoskeletalní motory
• Myosin - svalová kontrakce, transport váčků
• Kinesin - transport váčků po mikrotubulech od jádra
• Dynein - transport váčků po mikrotubulech k jádru, pohyb bičíků
•„Motory“ nukleových kyselin:
• Helikasy – oddělují řetězce DNA … (transkripce, replikace …)
• SMC proteins – zodpovědné za vytváření smyček na chromatinu
• RNA polymerasa – přepisuje DNA do RNA
• DNA polymerasa – syntetizuje druhý řetězec na ssDNA
• Topoisomerasa - redukce supercoiling DNA
• RSC a SWI/SNF - komplexy remodelují chromatin
viz dále …
Molekulární motory
Replikace DNA (video): DNA helikasa (modrá) “denaturuje” dvoušroubovici–
připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové)
spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován
kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován
(RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty).
Dynamika komplexů - PPI
ATP, DNA … moduluje interakce
https://www.biointeractive.org/classroom-resources/dna-replication-advanced-detail
Kelch et al, BMC Biol, 2012
Kelch et al, BMC Biol, 2012
Kelch et al, Science, 2011ATP modulace - clamp loader
ATP
ADP
Aktivovaný (ATP) clamp loader interaguje s PCNA a otevírá ji pro DNA. Vazba
DNA stimuluje hydrolýzu ATP a uvolnění clamp loader (uzavřeného s DNA).
PCNA
Zheng a spol, PNAS, 2020
- - polδ-PCNA „dojede“ k RNA primeru (zastaví)
- - Fen1 (nucleasa) se naváže na vedlejší PCNA protomer
(PIP místo) a rozštěpí RNA
- - ligasa nahradí pol/Fen1 a spojí konce DNA
interakce PCNA
PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1ZhengaShen,JMolCellBiol,2011
Gaoaspol,MolCell,2012
- metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) se váže na
PCNA (vyštěpí RNA primer)
- demetylace a fosforylace disocuje Fen1 z PCNA
(po ubikvitinaci je degradován)
- poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí
cukrfosfátovou kostru …
Posttranslační (PTM) modifikace
modulují interkce (složení komplexu)
PCNA – regulace buněčného cyklu
p21 blokuje přístup polymerás – zastaví se
replikace a buněčný cyklus v S fázi
p21 je upregulován nádorovým supresorem p53
(v případě poškození DNA …)
Magaetal,FASEBJ,2004
p21 interaguje s
PCNA podobným
způsobem jako
polymerasy
(kompetuje)
Freudenthal et al, NSMB, 2010
pokud je DNA poškozená, polδ se
zastaví a je třeba poškození nejdříve
opravit nebo ji „zastoupit“ jinou
polymerásou, která poškozené místo
„toleruje“ a překopíruje
(translesion synthesis) – přepíná se
ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) TLS
polymerasy (η, ι, κ) obsahují PIP a
UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA
Bergink & Jentsch, Nature, 2009
Sale et al, JCS, 2012
Oprava DNA: PCNA-ptm
TLS polymerasy (η, ι, κ)
obsahují UBM (tolerují
poškozené báze a
„zreplikují“ DNA)
Srs2 (antirekombinása)
obsahuje SIM (nedovolí
rekombinaci na
zastavených replikačních
vidličkách)
Template switch
K63 polyUb
PCNA asociuje s CAF1 (chromatin
assambly factor) a pomáhá
znovunavázání histonů (nukleosomů) a
vzniku chromatinu
Dohke et al, Genes to Cells, 2008
Ransom et al, Cell, 2010
PCNA je “swiss-army knife”
(PCNA je „core – jádro“ komplexů)
PCNA – moduly
PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“
tj. s mnoha funkčními moduly
- Loading
- Sliding
- Terminace
- Buněčný cyklus
- TLS a oprava DNA
- Chromatinizace … Moldovan et al., Cell, 2007
Gavin et al., Nature, 2006; Krogan et al, Nature, 2006
komplexom kvasinky Saccharomyces cerevisiae
2
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
bakteriální toxin
porin v mitochondrii
– komplexy mohou být dynamičtější - modulárnější …
– evoluční výhoda podjednotek (nový komplex vzniká duplikací
a novou kombinací podjednotek/modulů)
– skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné,
reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství
relativně slabých interakcí - nízká energie)
– skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je
transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá =>
stává se toxickým až mimo původní buňku)
– velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně
krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší
je méně stabilní a hůře se skládá)
– menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen
=> méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám –
odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší
podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury)
Proč skládat komplexy z menších podjednotek?
Kde najít více proteinových komplexů = PDB
Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatin
proteasom
Příklady komplexů
chaperon
apoptosom
ATP pumpa
Více CG030
Shrnutí
• Proteiny spolu interagují a takto se mohou stát součástí
jednoho (stabilní) nebo více komplexů (dynamické/modulární)
• Dynamické/modulární komplexy (PCNA)
– množství podjednotky determinuje složení komplexu
– Interakce/složení podjednotek dynamických komplexů jsou
modulovány např. posttranslačními modifikacemi
• Stabilní komplexy (ATPasová pumpa)
– podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je
vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost)
– stabilní komplexy disociují proteolyticky
– pokles hladiny jednoho proteinu má za následek pokles
hladiny ostatních podjednotek
CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů
jarní semestr - doc. Jan Paleček
Kvíz – zapište komplexy či „molekulární stroje“,
které jste zahlédli během videoprojekce
Molecular machinery of life:
https://www.youtube.com/watch?v=FJ4N0iSeR8U