Test inhibice růstu zelené řasy Raphidocelis subcapitata Obsah obrázku interiér, láhev, plavidlo, zelená Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku interiér, trouba, vykachlíkované Popis byl vytvořen automaticky https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-201-alga-growth-inhibition-test_9789264069923-en OECD Guideline 201 Test inhibice růstu zelené řasy Raphidocelis subcapitata Obsah obrázku interiér, láhev, plavidlo, zelená Popis byl vytvořen automaticky Obsah obrázku interiér, trouba, vykachlíkované Popis byl vytvořen automaticky •Sledujeme růst řas v čase •Srovnáváme růstovou rychlost řasové kultury ve variantě ošetřené testovanou látkou a kontrolní variantě •Test trvá 72h •Řasy kultivujeme v růstovém médiu – Erlenmayerovy baňky nebo 96-ti jamkové mikrodesky •Vlivem testované látky může dojít k inhibici nebo stimulaci růstu •Míru růstu můžeme stanovit – počítáním buněk, spektrofotometricky (absorbance chlorofylu A680) Plánování experimentu - obecně •Ředění řasové suspenze •Ředění testované látky – rozpustnost ve vodě, rozpouštědlo? •Ředění pozitivní kontroly – dichroman draselný (ve vodě) • •Rozložení na desce / potřebný objem • •Načasování měření 125 uL řasová suspenze v médiu 125 uL médium + testovaná látka v rozpouštědle •Jamka na desce – objem 250 uL •Jedna jamka = 1 experimentální varianta – zpravidla v několika opakováních (typicky 3) •Relevantní kontroly – negativní, rozpouštědlová, blanky •Potřebný materiál, lab. nádobí, chemikálie Triclosan XX mg/L v MeOH koncentrace se v jamce 2x sníží (rozředí) Příklad triclosan: cílová koncentrace v jamce 500 ug/L – 166 ug/L – 55.5 ug/L – 18.5 ug/L – 6.2 ug/L (3x ředicí řada) Triclosan rozpuštěný v MeOH: c= XX mg/L ?? Maximální obsah rozpouštědla v testovém systému – 0.5% 125 uL řasová suspenze v médiu 125 uL médium + testovaná látka v rozpouštědle 1% → 1485 1000 1000 1000 1000 Objemy v uL: 15 uL (1%) 500 500 500 500 1000 ug/L 332 ug/L 111 ug/L 37 ug/L 12.3 ug/L Koncentrace: Obsah obrázku láhev, víčko/poklička, Nádoby na skladování potravin, Řešení Popis byl vytvořen automaticky Potřebný objem na jednu koncentrační variantu: 125uL x 5 = 625 uL + rezerva 1000uL 3x ředicí řada = ředění 1:2 Triclosan XX mg/L v MeOH 1485 1000 1000 1000 1000 Objemy v uL: 15 uL (1%) 500 500 500 500 1000 ug/L 332 ug/L 111 ug/L 37 ug/L 12.3 ug/L Koncentrace: Jak zajistíme ve všech koncentračních variantách triclosanu stejnou koncentraci rozpouštědla (MeOH) 1%? 3x ředicí řada = ředění 1:2 Triclosan XX mg/L v MeOH 1485 1000 1000 1000 1000 Objemy v uL: 15 uL (1%) 500 500 500 500 1000 ug/L 332 ug/L 111 ug/L 37 ug/L 12.3 ug/L Koncentrace: Jak zajistíme ve všech koncentračních variantách triclosanu stejnou koncentraci rozpouštědla (MeOH) 1%? 3x ředicí řada = ředění 1:2 Předmíchám si médium + 1% MeOH a rozpipetuju do jednotlivých variant – potom postupné ředění 4x1000uL = 4mL + rezerva 5mL + 50uL MeOH ZBB médium Diuron 20 mg/L v MeOH 1485 1000 1000 1000 1000 Objemy v uL: 15 uL (1%) 500 500 500 500 200 ug/L 66.6ug/L 22.2 ug/L 7.4 ug/L 2.47 ug/L Koncentrace: Jak zajistíme ve všech koncentračních variantách triclosanu stejnou koncentraci rozpouštědla (MeOH) 1%? 3x ředicí řada = ředění 1:2 Předmíchám si médium + 1% MeOH a rozpipetuju do jednotlivých variant – potom postupné ředění 4x1000uL = 4mL + rezerva = 5mL Solvent control = 125uL x 10 = 1250 + rezerva =1.5mL Celkem 6.5mL + 65uL MeOH ZBB médium Dichroman 2 g/L ve vodě 1980 1000 1000 1000 Objemy v uL: 20 uL (1%) 1000 1000 1000 20 mg/L 10 mg/L 5 mg/L 2.5 mg/L Koncentrace: 2x ředicí řada = ředění 1:1 ZBB médium Materiál k experimentu • •1x vanička na multikanál pipetu •Multikanál pipeta 300uL •Pipety 5mL, 1000uL, 200uL, 20uL + špičky •2x kádinka •10 vialek (20mL) •Řasová suspenze, 50% ZBB médium •Transparentní PS 96-jamková deska s víčkem •Methanol/DMSO •Popisovače •Zásobní roztok diuronu a dichromanu •