Manuál k předmětu
Obecná ekotoxikologie – cvičení (E5081)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí - RECETOX
Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita
Brno, Česká Republika
2024
1. Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea)
Zkouška akutní toxicity
Zpracováno podle ČSN ISO 6341
Vyučující: marie.smutna@recetox.muni.cz
Metoda stanovení akutní toxicity chemických látek, průmyslových odpadních vod a
povrchových nebo podzemních vod pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea).
Princip
Zkouška je založena na určení koncentrace látky, která za 24 (48) hodin imobilizuje 50 %
jedinců Daphnia magna vystaveným podmínkám testu.
Přístroje a chemikálie
- automatická pipeta + špičky
- plastová kapátka
- testovací destička (30 jamek, objem jamky 10 mL)
- kádinky
- odměrný válec
- chemikálie na přípravu média - chlorid draselný KCl, hydrogenuhličitan sodný NaHCO3,
chlorid vápenatý CaCl2
, síran hořečnatý MgSO4
- pozitivní kontrola - dichroman draselný K2
Cr2
O7
Podmínky testu
- teplota: 20 ± 2 ºC
- délka expozice 24hod (48 hod.)
- fotoperioda 16h světla/8 h tmy
Příprava experimentu a pracovní postup
Příprava média
Nejprve je třeba připravit dostatečné množství média pro všechny kroky postupu
experimentu.
Zásobní roztoky:
8,88g CaCl2
se rozpustí v 1L destilované vody
4,93g MgSO4
se rozpustí v 1L destilované vody
2,59g NaHCO3
se rozpustí v 1L destilované vody
0,23g KCl se rozpustí v 1L destilované vody
- na 1L média se dávkuje 25 mL z každého zásobního roztoku, do odměrné baňky 1L se
nalije část destilované vody, přidají se zásobní roztoky a doplní se destilovaná voda
- aerací se roztok nasytí kyslíkem (koncentrace kyslíku by neměla klesnout pod 7 mg/L) a
zkontroluje se pH (7,8±0,2)
Příprava organismů na test
Do experimentu se nasazují jednodenní juvenilové, proto je potřeba 1 den před založením
experimentu vyčlenit do speciální nádoby – kádinky (0.5L) s médiem několik gravidních samic.
Toto přenesení samic do oddělené nádoby je impulsem k rození mláďat.
Příprava koncentrační řady testované látky - standardní toxikant dichroman draselný
Ředicí řadu testované látky (5 konc. bodů) připravíme v dostatečném objemu ve skleněných
kádinkách. Z kádinek potom napipetujeme po 10 mL do každé testové jamky v plastové
testovací desce dle doporučeného schématu. Na každou koncentraci připadá 5
opakování/jamek, přičemž první jamka v řadě slouží jako jamka ředící/ na oplach.
Nasazení organismů do testu
Do jamky na oplach přeneseme kapátkem 20 jedinců z nádoby s juvenily a po-té přenášíme po
5 jedincích do jednotlivých testových jamek. Tímto zabráníme nežádoucímu naředění
testované látky při manipulaci s kapátkem.
X A B C D
NC kontrola kontrola kontrola kontrola kontrola
1 C min C min C min C min C min
2
3
4
5 C max C max C max C max C max
Tab. 1: testovací deska na Daphniový test
X….ředící jamka
A,B,C,D …opakování jedné koncentrace
Expozice a vyhodnocení imobilizace
Desku s dafniemi necháme exponovat v kultivační laboratoři při teplotě 20 ± 2 ºC a světelném
režimu 16h světlo/8h tma.
Na konci zkušební doby 24h (48h) se spočítají mobilní jedinci v každé nádobě. Jedinci, kteří
nebudou schopni se rozplavat za 15 s po mírném zamíchání roztoku, se považují za
imobilizované, i kdyby dosud pohybovali tykadly.
Výsledky včetně jakýchkoli anomálií v chování dafnií si zaznamenáme.
Vyhodnocení výsledků a výpočty
Výsledky zaznamenáme do Excelu a jednoduchým výpočtem určíme % imobilizace v
jednotlivých opakováních, odhadneme EC20, EC50, NOEC a LOEC.
Platnost zkoušky
Zkouška se považuje za platnou, pokud jsou splněny následující podmínky:
• Mortalita/Imobilizace v kontrole na konci zkoušky je ≤ 10%
• 24h- EC50
pro dichroman draselný je v rozsahu 0.6-2.1 mg/l
Akutní dafniový test – protokol
Datum založení:
Vzorek/testovaná látka:
Testované koncentrace:
Výsledky:
24h
koncentrace A B C D
celkový počet
testovaných
organismů
celkový počet
imobilizovaných
organismů
% inhibice
NC
48h
koncentrace A B C D
celkový počet
testovaných
organismů
celkový počet
imobilizovaných
organismů
% inhibice
NC
2. Test klíčivosti semen a inhibice růstu kořene
hořčice bílé (Sinapis alba - Brassicaceae)
Zkouška akutní toxicity
Zpracováno podle OECD Guidline No.208: Terrestrial plants, growth test
Vyučující: jiri.novak@recetox.muni.cz
Úvod:
Ve skleněných Petriho miskách jsou semena hořčice seté umístěna na filtrační papír a
exponována 5 mL standardního média s různým ředěním testované látky. Jako negativní
kontrola slouží varianta se semeny exponovanými jen čistým médiem.
Po ukončení experimentu se stanoví počet vyklíčených semen v kontrolách a v jednotlivých
ředěních a u vyklíčených jedinců se vyhodnotí celková délka kořene. Získané výsledky lze
využít pro výpočet hodnot IC50 (koncentrace zabraňující vyklíčení u 50 % semen, resp.
koncentrace inhibující z 50 % růst kořene).
Metodika testu klíčení je standardizována do podoby Guideline OECD (No. 208) a metodického
pokynu MŽP ČR pro hodnocení toxicity odpadů a vodných výluhů (Test inhibice růstu kořene
Sinapis alba, Vyhl. MŽP ČR 338/1997). Ve standardní podobě se provádí 4 dny (96 hodin). Pro
účely cvičení může byla doba expozice modifikována na 72hodin.
Materiál a chemikálie
- semena hořčice bílé Sinapis alba (ideálně s atestem testu klíčivosti) – 30 min dopředu
ponořené v destilované vodě
- skleněné Petriho misky o průměru 10 cm, pipety 5 a 10 mL, automatické mikropipety,
filtrační papír, vialky pro přípravu ředění testované látky, pinzeta, laboratorní plastiková folie,
špičky k pipetám
- zásobní roztok standardního kultivačního média
Tab. 1: Zásobní roztoky solí pro testy na semenech hořčice bílé
Zásobní roztok Chemikálie Koncentrace v zásobním
roztoku [g·l-1]
Roztok 1 CaCl2·2H2O 117,6
Roztok 2 MgSO4·7H2O 49,3
Roztok 3 NaHCO3 25,9
Roztok 4 KCl 2,3
Příprava média: napipetovat 5 ml každého roztoku a doplnit do 1 l destilovanou vodou.
Případně upravit pH na 7,6-8.
Postup 1 - příprava EXPOZICE:
1) Petriho misky popište jménem, datem, koncentrací testované látky. Do takto připravených
Petriho misek připravte a vložte kruhové výseče z filtračního papíru. Test bude proveden v
duplikátech - celkem připravte 8 Petriho misek (2x kontrola + 2x 3 ředění vzorku A).
2) Příprava ředění vzorku
- připravte následující koncentrace dodaného testovaného vzorku
(vzorek A): 0.11% v/v, 0.33% v/v, 1% v/v (do 15 mL standardního média napipetujete
potřebný objem testovaného vzorku pro získání nejvyšší testované koncentrace - změnu
celkového objemu zanedbejte, promíchejte a proveďte sériové naředění do nižších
koncentrací tj. ředění 1:2 5ml naředěného vzorku + 10 ml média)
- ředění proveďte v dodaném standardním médiu (roztok solí a základních živin nutných pro
klíčení rostlin).
3) Připravené expoziční roztoky dávkujte do Petriho misek - vždy 5 mL / misku
- u kontrol použijte 5 mL standardního média bez vzorku
- použijte jednu pipetu a postupujte od nejnižší po nejvyšší koncentraci
4) Do každé misky vložte 5 semen hořčice bílé (rozmístěte dostatečně od sebe)
5) Petriho misky překryjte potravinovou folií (zajistí cirkulaci vzduchu a omezí vypařování) a
umístěte do temna do inkubační místnosti (pokojová teplota)
Postup 2 - vyhodnocení:
1) Po ukončení expozice spočítejte počty nevyklíčených semen na jednotlivých miskách a
zapište do tabulky
2) U vyklíčených semen vyhodnoťte délku kořene (s přesností na milimetry) a zapište do
tabulky
Obsah protokolu:
1) Tabulky s naměřenými hodnotami
2) Tabulky s vypočítanými inhibicemi (pentaplikát, průměr, směrodatná odchylka)
3) Grafy popisující závislost dávka-odpověď (koncentrace látky v logaritmované podobě)
4) Proložení lineární regrese modelu grafy a výpočet hodnot IC50 pro klíčivost a inhibici
růstu kořene (Excel)
5) Závěr – shrnutí a zhodnocení výsledků, odpověď na otázky níže
PROTOKOL - Cvičení z Obecné ekotoxikologie
TEST EKOTOXICITY KLÍČENÍ ROSTLIN:
Jména operátorů:
Datum založení expozice:
Datum hodnocení toxicity:
-> délka expozice (počet dní):
Testovaný vzorek (koncentrace % v/v)
Rostlina číslo Kontrola 0,25% (v/v) 0,5% (v/v) 1% (v/v) Pozn.
Celkem semen 10 10 10 10
Počet nevyklíčených
Délky kořenů - Miska A
1
2
3
4
5
Délky kořenů - Miska B
1
2
3
4
5
Průměr délky kořenů
(mm)
Procenta kontroly (%) 100
Směrodatná odchylka (%)
Procenta inhibice (%) 0
Směrodatná odchylka (%)
IC50 - klíčení (% v/v)
IC50 - růst kořene (% v/v)
Otázky do protokolu:
1) Který z hodnocených parametrů je citlivějším ukazatelem toxicity?
2) Jak věrohodné jsou vypočítané hodnoty IC50? Bylo by potřeba v postupu něco modifikovat?
(ředění, opakování…)
3) Jaké množství testované látky způsobí inhibici růstu kořene o 99 %? Je tento výsledek
věrohodný?