Úvod do wet lab aspektů experimentů alias správná laboratorní praxe Petra Vídeňská videnska@mendelu.cz Praha 8.2.2024, AVČR WET LAB VS. DRY LAB Wet lab vs. Dry lab Wet lab -Fyzická laboratoř pro práci s biologickými, chemickými nebo jinými materiály -Tvorba „vstupů“ pro Dry lab Dry lab - Práce s daty (bioinformatika, statistika), simulacemi a teoretickými modely. Wet lab vs Dry lab Wet lab Dry lab Design studie Analýza vzorků Bioinformatická analýza Statistická analýza Přeměření, doměření, validace Dry lab význam •Nové technologie (sekvenátory, hmotnostní spektrometry) produkují velké množství dat, které je potřeba správně zpracovat. •Wet lab a dry lab se vzájemně doplňují, ale díky vzrůstajícímu množství dat se v moderním výzkumu stále více času tráví v dry lab prostředí, kde se analyzují výsledky. • OD VÝVOJE METODY K AKREDITACI Různé typy laboratoří potřebují různé přístupy Od optimalizace k akreditaci Vývoj nových metod Optimalizace metod SOP Validace Kontrola kvality Akreditace Optimalizace •Cíl: Zlepšení technik a metod, aby byly co nejefektivnější a nejpřesnější. •Klíčové kroky: •Výběr nejvhodnějších postupů na základě předchozích studií nebo experimentů. •Úprava metodiky pro konkrétní podmínky (např. upravit teplotu, použít jiné reagencie). •Testování na malém měřítku s cílem minimalizovat chyby a zvýšit efektivitu. •Výsledek: Optimalizované metody jsou připravené k širšímu použití, ale zatím nejsou plně validované. • SOP •Standardní operační postupy (SOP) •Cíl: Zavedení standardizovaných pokynů pro provádění optimalizovaných metod. •Klíčové kroky: •Podrobný popis všech kroků experimentu (od přípravy vzorků po kalibraci přístrojů). •Stanovení kontrolních opatření (pozitivní a negativní kontroly). •Zajištění jednotné aplikace metod v celé laboratoři. •Výsledek: SOP zajišťují, že metoda je prováděna konzistentně napříč různými uživateli. •Příklad • Validace •Cíl: Ověření, že metoda poskytuje spolehlivé a opakovatelné výsledky. •Klíčové kroky: •Testování opakovatelnosti metody na stejném vzorku vícekrát. •Ověření přesnosti a citlivosti metody pomocí referenčních materiálů nebo standardů. •Porovnání s jinými validovanými metodami, aby bylo možné ověřit správnost výsledků. •Výsledek: Metoda je prokázána jako spolehlivá a připravená k širšímu použití v laboratoři. • Kontrola kvality •Cíl: Zajištění, že metoda je při každém použití spolehlivá a stále poskytuje přesné výsledky. •Klíčové kroky: •Zavedení interních i externích kontrolních mechanismů (např. pravidelné testování referenčních vzorků). •Monitorování dlouhodobé stability metod a pravidelné ověřování přístrojů (kalibrace). •Výsledek: Metoda prochází pravidelnými kontrolami, které zaručují její konzistenci. • Akreditace •Cíl: Formální uznání toho, že metoda splňuje určité normy a je prováděna v souladu s mezinárodními standardy. •Klíčové kroky: •Dodržování předpisů a standardů (např. ISO/IEC 17025 pro zkušební a kalibrační laboratoře). •Externí audit a inspekce nezávislým akreditačním orgánem. •Zavedení systému řízení kvality, který pokrývá všechny aspekty laboratorní činnosti. •Výsledek: Laboratoř nebo metoda získává akreditaci, což znamená, že její postupy splňují nejvyšší požadavky na kvalitu a reprodukovatelnost. • Systém řízení kvality •Systém řízení kvality (Quality Management System, QMS) je strukturovaný soubor procesů a procedur, které zajišťují, že laboratorní činnosti a metody splňují vysoké standardy přesnosti, spolehlivosti a reprodukovatelnosti. SPRÁVNÉ PLÁNOVÁNÍ Správné plánování • •Klíčem k úspěšné studii je věnovat čas přípravě. Správné plánování •1. Stanovení hypotézy •Dobře naplánovaný experiment: •Hypotéza je jasně formulována a vychází z důkladného průzkumu literatury. •Příklad: „Přítomnost specifických druhů bakterií v půdě zvyšuje růst rostlin díky lepší fixaci dusíku.“ •Špatně naplánovaný experiment: •Hypotéza je vágní a nejasná, neexistuje dostatečný průzkum předchozích studií. •Příklad: „Rostliny by mohly růst lépe s bakteriemi v půdě.“ – chybí přesnost, konkrétní druhy a mechanismus. • Správné plánování •2. Průzkum literatury •Dobře naplánovaný experiment: •Pečlivý průzkum literatury zahrnuje aktuální studie, které potvrzují předpoklady a navrhují vhodné metody. •Příklad: Citování několika studií o fixaci dusíku a identifikace konkrétních mikroorganismů. •Špatně naplánovaný experiment: •Omezený nebo žádný průzkum literatury, což vede k nevhodné metodologii nebo opakování již známých chyb. •Příklad: Přeskočení průzkumu, žádná konkrétní podpora hypotézy. • Správné plánování •3. Výběr metod •Dobře naplánovaný experiment: •Zvolená metoda je vhodná pro odpověď na stanovenou hypotézu, založená na validovaných postupech z literatury. •Příklad: Použití sekvenování DNA k identifikaci mikroorganismů v půdě a měření fixace dusíku. •Špatně naplánovaný experiment: •Nevhodná metoda, která není schopná odpovědět na otázky hypotézy. •Příklad: Použití obecného mikrobiologického postupu bez zajištění specifické detekce fixujících mikroorganismů. • Správné plánování •4. Kontrolní skupiny •Dobře naplánovaný experiment: •Správně definované pozitivní a negativní kontrolní skupiny pro ověření správnosti výsledků. •Příklad: Kontrolní půda bez mikroorganismů (negativní kontrola) a půda s bakteriemi známými pro fixaci dusíku (pozitivní kontrola). •Špatně naplánovaný experiment: •Žádné nebo nedostatečné kontrolní skupiny, které by validovaly experimentální data. •Příklad: Nepřítomnost kontrolních skupin, takže výsledky nelze spolehlivě interpretovat. Správné plánování •5. Kalibrace přístrojů •Dobře naplánovaný experiment: •Přístroje jsou udržovány a pravidelně kontrolovány •Špatně naplánovaný experiment: •kontrola není prováděna nebo je provedena špatně, což vede k chybným výsledkům. •Příklad: Kontaminace v přístrojích, chyby při měření Správné plánování •6. Správné vedení záznamů •Dobře naplánovaný experiment: •Všechny kroky experimentu jsou přesně zaznamenány do laboratorního deníku (papírového nebo digitálního), což zajišťuje možnost opakování experimentu. •Příklad: Každé měření, změna protokolu nebo pozorování jsou pečlivě zapsány, včetně časových údajů a podmínek. •Špatně naplánovaný experiment: •Nedostatečné vedení záznamů, což ztěžuje reprodukci experimentu. •Příklad: Chybí záznamy o klíčových krocích experimentu, změnách metod nebo podmínkách měření. • Správné plánování •7. Reprodukovatelnost •Dobře naplánovaný experiment: •Experiment je navržen tak, aby ho mohl zopakovat jiný tým, a to díky jasné dokumentaci a důkladnému plánování. •Příklad: Jasné instrukce a dobře vedený deník umožňují jiným vědcům zopakovat experiment se stejnými výsledky. •Špatně naplánovaný experiment: •Experiment je těžko reprodukovatelný kvůli nedostatečné dokumentaci, chybám v metodologii nebo chybějícím kontrolám. •Příklad: Jiný tým nedokáže dosáhnout stejných výsledků kvůli nedostatečným informacím a nepřesnostem. • DESIGN STUDIE Design studie •Ujasnění odebírání a uchovávání vzorků: Zajistit, že způsob odběru a uchovávání vzorků je v souladu s jinými studiemi. •Sběr dalších informací o vzorku: Nejen informace o vzorku samotném, ale také detaily o pacientovi či prostředí (např. teplota, vlhkost, umístění) – dobré promyslet množství informací vs. množství vzorků •Projednání se statistikem: Statistická podpora je klíčová, aby bylo zajištěno, že design experimentu je robustní a výsledky statisticky validní. •Počet vzorků – věda vs. realita: Vědecký ideál (velké množství vzorků pro statistickou sílu) se často musí přizpůsobit realitě (čas, finance, dostupnost pacientů). •Zařazení a vyloučení pacientů (nebo lokalit sběru vzorků): Definování jasných kritérií pro to, kdo nebo co bude zahrnuto do studie (předcházet chybám a zkreslení) •Dotazníky: Použití již validovaných dotazníků, pokud je to možné, pro zajištění konzistence a spolehlivosti dat. –Převzatý vs. vlastní dotazník: Vytváření nových dotazníků je složité, proto je často lepší adaptovat již ověřené formáty. Design studie •Co dalšího je potřeba vzít v úvahu? • Etické aspekty –Zvlášť důležité v klinických a zvířecích studiích. Výzkum by měl být navržen s ohledem na etiku, což zahrnuje získání informovaného souhlasu účastníků a minimalizaci škod nebo rizik pro subjekty. •Pilotní studie –Malý předběžný experiment, který se provádí před plnohodnotnou studií. Cílem pilotní studie je otestovat proveditelnost experimentu, validovat metodiku a identifikovat potenciální problémy. –Pomáhá odhalit metodologické chyby nebo problémy s logistikou, což může ušetřit čas a zdroje během hlavní studie. • ORGANIZACE PRÁCE V LABORATOŘI Organizace práce: Efektivní rozdělení labotoře/í •Zóny v laboratoři: •Laboratoř rozdělena do specifických zón podle typu činnosti (např. příprava vzorků, analýza, skladování). •Minimalizace pohybu se vzorky: Uspořádání laboratoře tak, aby kroky experimentu na sebe logicky navazovaly a vzorky nemusely „cestovat“ po laboratoři, čímž se snižuje riziko kontaminace. •Jasná pravidla na viditelných místech: •Pravidla a postupy pro práci a úklid jsou viditelně vyvěšeny v laboratoři, aby se zajistilo jejich dodržování. • Organizace práce: Efektivní rozdělení labotoře/í Organizace práce: Příprava před zahájením práce •Naplánování práce předem: •Teoretický průchod protokolem: Před vstupem do laboratoře si podrobně projít postup, aby bylo zajištěno, že je vše správně pochopeno a jsou připravené všechny potřebné materiály. •Kontrola připravenosti: •Zkontrolovat, zda jsou všechny reagencie a vybavení nachystány a zda jsou dostupné všechny pomůcky. •Pokud není vše připravené, neprovádět experiment, dokud není k dispozici vše, co je potřeba. • Organizace práce: Udržování pořádku a přístrojů •Pravidla pro úklid po práci: •Pravidelný úklid pracovní plochy po každém použití a po každé fázi experimentu, aby se minimalizovalo riziko kontaminace a chyb. •Pravidla pro přípravu pracovního místa: Vždy začít s čistou plochou, nastavit vše předem. •Údržba přístrojů: •Každý přístroj musí mít jasné pokyny pro použití a údržbu, které jsou vyvěšené u přístroje nebo snadno dostupné. •Vedení záznamů o údržbě a opravách: Kdy byl přístroj naposledy čištěn nebo opraven? Kdo provedl údržbu? •Pravidelné kontroly stavu: Pravidelně kontrolovat stav přístrojů a nástrojů (např. kalibrace, čištění) a zaznamenávat do protokolu. •Příklad • Organizace práce: Zajištění dostatku materiálu •Dostatek materiálu v laboratoři: •Pravidelně kontrolovat zásoby a zajišťovat, že všechny nezbytné reagencie a materiály jsou k dispozici v dostatečném množství. •Zavedení systému pro sledování zásob (např. inventární systém nebo LIMS), který pomáhá předcházet výpadkům. Organizace práce: Příprava před zahájením práce – check list •Obecné zásady 1.Zásobování a materiály: oVšechny reagencie a spotřební materiál byly před zahájením experimentu zkontrolovány (dostupnost a exspirace). oMateriály a pomůcky byly správně tříděny pro pre-PCR a post-PCR zónu. 2.Bezpečnostní opatření: oJsou dodržovány všechny bezpečnostní protokoly, včetně nošení OOP. oByla ověřena dostupnost havarijních prostředků (např. neutralizační roztoky, první pomoc). • Organizace práce: Příprava před zahájením práce •PCR Laboratoř – Checklist •1. Pre-PCR zóna (Příprava vzorků a reakčních směsí) 1.Čistota pracovní plochy a vybavení: oPracovní plocha byla před prací dekontaminována (např. 70% ethanol, UV světlo). oPoužité pipety byly dekontaminovány a jsou určeny pouze pro pre-PCR práci. oSpotřební materiál (špičky, zkumavky) je sterilní a je určen pouze pro pre-PCR zónu. 2.Příprava reagencií a vzorků: oReagencie jsou správně rozmrazené a připravené. oByly použity filtrační špičky (pro snížení rizika křížové kontaminace). oDNA/RNA vzorky byly přidávány naposledy, aby se omezila možnost kontaminace. oVšechny zkumavky a reakční směsi jsou označeny podle protokolu. 3.Osobní ochranné prostředky (OOP): oVšechny osoby v pre-PCR zóně mají na sobě OOP. oRukavice byly vyměněny před vstupem do pre-PCR zóny. 4.Záznamy a protokoly: oVedené laboratorní deníky zahrnují všechny důležité detaily (datum, časy, typ vzorků, použité reagencie). oProtokol byl zkontrolován a je připraven pro další kroky. • Organizace práce: Příprava před zahájením práce •2. Post-PCR zóna (Amplikace DNA a analýza) 1.Přesun z pre-PCR do post-PCR zóny: oVšechny pracovní plochy v post-PCR zóně byly dekontaminovány před začátkem experimentu. oPro přechod do post-PCR zóny byly vyměněny rukavice a laboratorní plášť. oVeškeré použité pipety, zkumavky a další pomůcky jsou určeny pouze pro post-PCR zónu. 2.Umístění a provoz PCR cykleru: oPCR cykler byl zkontrolován a je v provozuschopném stavu (správně nastavený teplotní profil). oReakční směsi byly správně umístěny do cykleru. oPCR cykler je umístěn v post-PCR zóně, kde nedochází ke křížové kontaminaci. 3.Analýza výsledků (např. elektroforéza): oByly použity nové rukavice pro práci s PCR produkty. oAgarózový gel byl připraven v post-PCR zóně. oElektroforéza byla provedena s přístroji a materiály určenými pro post-PCR práci. 4.Úklid a údržba: oPracovní plocha a přístroje byly po ukončení experimentu dekontaminovány. oZáznamy o provedené údržbě přístrojů a sanitaci byly doplněny do laboratorního deníku. oSpotřební materiál (špičky, zkumavky) byl správně zlikvidován dle laboratorních předpisů. • LABORATORNÍ DENÍKY Laboratorní deníky: Význam •Reprodukovatelnost experimentů: •Přesné a pečlivé vedení záznamů umožňuje opakování experimentů jinými výzkumníky za stejných podmínek. •Bez pečlivých záznamů může být těžké interpretovat výsledky nebo zjistit příčinu chyb. •Sbírání metadat: •Kromě hlavních výsledků je důležité zaznamenávat také metadata (např. „vzorek XY po izolaci byl zabarven do žluta“). •Využití v analýzách: Metadata mohou být následně využita pro statistické analýzy. Mohou například odhalit vzorce, jako je opakující se nízká výtěžnost u určité osoby nebo změny v mikrobiálním složení vzorků izolovaných určitým lotem kitu. •Pomoc při odhalování procesních chyb: Tyto záznamy mohou pomoci odhalit skryté chyby v procesech nebo vybavení, které mohou ovlivnit výsledky. •Optimalizace a SOP: •Laboratorní deník: V průběhu optimalizace procesu je důležité dokumentovat všechny změny a zlepšení. •Přepis do SOP: Jakmile je proces optimalizován, měl by být přepsán do Standardních operačních postupů (SOP) a kategorizován, aby byl jednoduše opakovatelný. •Elektronická forma: Přehledný zápis v elektronické formě usnadňuje následné vyhodnocování a sledování trendů. • Laboratorní deníky: Obsah •1. Základní informace o experimentu •Kdo: Jméno osoby, která provádí experiment. •Kdy: Datum a čas každého kroku experimentu. •Co: Jasný a podrobný popis toho, co bylo provedeno, včetně metod a použitých technik. •2. Použité materiály a vybavení •Reagencie a chemikálie: –Názvy použitých látek, šarže a expirační doby. –Informace o původu reagencií (dodavatel, katalogové číslo). •Laboratorní přístroje: –Použité přístroje a jejich stav (např. kdy byl přístroj naposledy kalibrován). –Specifické nastavení přístrojů (např. teploty, rychlosti, časové intervaly). •3. Procesní kroky •Postup experimentu: •Podrobné popisy každého kroku experimentu, aby bylo možné jej reprodukovat. •Zaznamenání časů jednotlivých kroků (např. doba inkubace, časy měření). •Odběr vzorků: •Specifikace vzorků, včetně způsobu odběru, uchovávání, identifikace (např. vzorek č. 1, teplota skladování). •Přesné sledování kroků: •Například u PCR záznam o přípravě směsí, programování cykleru a parametry cyklu. • – – – • • Laboratorní deníky: Obsah •4. Sledování kritických parametrů •Podmínky experimentu: •Záznam o podmínkách experimentu, jako jsou teplota, vlhkost, pH, atmosférické podmínky apod. •Kontroly: •Záznam o použití pozitivních a negativních kontrol, jejich výsledky a hodnocení. •Metadata: •Poznámky o jakýchkoli odchylkách nebo neobvyklých pozorováních (např. změna barvy vzorku, změna konzistence). •5. Výpočty a analýza •Záznamy o výpočtech: •Všechny potřebné výpočty (např. koncentrace, ředění, množství reagencií). •Detailní popis výpočtových kroků včetně vzorců a jednotek. •Statistická analýza: •Jaké statistické testy byly použity k vyhodnocení výsledků. •Způsob, jakým byly výsledky interpretovány a jak byly analyzovány v kontextu experimentu. •6. Výsledky a jejich interpretace •Primární data: •Zaznamenání všech výsledků, včetně surových dat (např. absorbance, naměřené hodnoty). •Grafy a vizualizace: •Vkládání nebo odkaz na grafy, obrázky, elektroforetické gely, spektra apod. •Interpretace výsledků: •Poznámky o významu výsledků a jejich vztah k hypotéze nebo výzkumné otázce. • • – – – • • Laboratorní deníky: Papírový vs. digitální •Papírové deníky: •Výhody: –Snadná dostupnost bez potřeby elektroniky nebo softwaru. –Někteří výzkumníci preferují přímý fyzický zápis. •Nevýhody: –Obtížná záloha (originál je jediný exemplář). –Riziko ztráty, poškození (např. polití, ohněm). –Omezená možnost vyhledávání a organizace informací. •Digitální deníky: •Výhody: –Snadné zálohování a sdílení dat s ostatními členy týmu. –Možnost vyhledávání v dokumentech, organizace dat, vkládání obrázků a grafů. –Kompatibilita s dalšími systémy, např. LIMS. •Nevýhody: –Potřeba elektronického zařízení (PC, tablet). –Závislost na softwaru a případných licencích. •Příklad • Laboratorní deníky: LIMS •LIMS (Laboratory Information Management Systems) •Co je LIMS: •Laboratory Information Management System (LIMS) je digitální systém, který spravuje všechny aspekty laboratorní činnosti, od správy vzorků přes experimentální data až po výsledky. •Funkce LIMS: •Sledování vzorků: LIMS umožňuje snadné sledování vzorků během jejich životního cyklu (příjem, analýza, skladování). •Automatizace záznamů: Umožňuje automatizované zaznamenávání výsledků experimentů a jejich propojení s konkrétními vzorky. •Sdílení dat a zálohování: Usnadňuje sdílení dat s ostatními vědci a automaticky zálohuje záznamy. •Výhody LIMS: •Rychlé vyhledávání informací, které šetří čas. •Zajišťuje konzistenci a kvalitu dat díky automatizaci procesů. •Umožňuje přehlednou správu vzorků a výsledků v rámci týmu nebo celé laboratoře. •Přímé čerpání strukturovaných dat: Datoví analytici mohou přímo z LIMS získávat strukturovaná data pro další analýzy, což zjednodušuje a urychluje proces zpracování da • KONTROLY Vzorky s nízkou abundancí bakteriální DNA •Často se jedná o vzorky tkání a tělních tekutin –Při infekcích způsobených vícero patogeny (špatně se uplatňují klasické metody) –Vzorky tumoru apod. (kolorektální karcinom, karcinom prsu) –Zdravé tkáně – přirozený mikrobiom? (mozek) –Mekonium, mohou to být i různé stěry – Velké množství humánní DNA •Ve vzorcích se bakteriální DNA může vyskytovat jen desetinách až setinách procent •Velký problém zejména u celometagenomového sekvenování (musí se odstranit), ale i u sekvenace genu pro 16S rRNA vznikají nespecificity •Řešení: –NEBNext® Microbiome DNA Enrichment Kit •Použití i na zmražený vzorek •Používá se až po izolaci DNA –Ultra-Deep microbiome Prep-Molzym •Použití na nezamražený vzorek •Slouží k izolaci bakteriální a fungální DNA ze vzorku tkáně nebo tělních tekutin –MolYsis™ complete 5 •Použití na nezamražený vzorek •Odstranění eukar. DNA •Degradace bakteriální b. stěny, purifikace mikrobiální DNA –Benzonázová metoda –Saponiny • • • • Kontaminace •Co je pravda a co pouze kontaminace? U vzorků s nízkou abundancí bakteriální DNA se mnohem pravděpodobněji projeví –Často u odběru nemožné odebrat naprosto sterilně –Kontaminace z lidí a prostředí –Kontaminace z kitů –Kontaminace ze sekvenátoru –… •Řešení –Negativní kontroly, stěry z prostředí, kontrola kitů, malý počet cyklů u sekvenace genu pro 16S rRNA, vysoká kvalita práce –Standardy – mock komunita, nasyntetizovaný interní standard • •Problém zejména u 16S, kde se kontaminace pomnoží a v podstatě samotný vzorek „přehluší“ Přidávání kontrol k mikrobiomovým studiím • Čím méně bakteriální DNA ve vzorku… …tím více pozitivních i negativních kontrol A také se vyplatí více hlídat procesní kroky – zapisovat si kdy, kde, kdo a co izoloval, loty kitů apod. Kontaminace u vzorků s nízkou koncentrací bakteriální DNA • Eisenhofer R. et al. Biomass Microbiome Studies: Issues and Recommendations, Trends in Microbiology, https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.11.003. Procesní kroky Negativní kontroly Negativní kontroly à kontrola kontaminace •Kontaminující DNA •Zkřížená kontaminace Negativní kontroly •První a poslední zkumavka •U destiček 8 jamek •Pokud se s kontaminací dále pracuje (do vyhodnocování) – 3 opakování Pozitivní kontroly Pozitivní kontroly àkontrola procesu •Cílem je získat očekávaný výsledek •Mohou být zpracovávány „vedle“ vzorku (klasické PK), nebo se přidávají ke vzorku (spike-in kontroly) Pozitivní kontroly •Celulární - bakteriální směs (Cellular Mock Community) •DNA standard •DNA izolovaná z mikroorganismů •Syntetická sekvence Pozitivní kontroly – klasické •Zpracovávají se jako vzorek •Slouží i k optimalizaci procesu, pomocí série ředění lze zjistit limity detekce, účinnost extrakce atd. •Může pomoci odhalit zkřížené kontaminace a chyby v procesu •DNA mock komunita pro kontrolu přípravy knihovny se považuje již za standard a bývá vyžadována při publikacích • Pozitivní kontroly – Spike-in •Přidávají se do vzorku •Mohou být i celulární (využití při extrakci) nebo DNA (lépe syntetická) •Výhody: –Pomohou připravit knihovnu i ze vzorků s nízkým množstvím bakteriální DNA –Kontrola inhibice PCR –Lze využít při odstraňování kontaminace bioinformaticky –Jedna kontrola pro bakterie i houby – může pomoci zjistit vzájemný poměr těchto dvou skupin MO ve vzorku –Kvantifikace? •Vlastnosti –Sekvence kontroly musí být odlišná od sekvencí přítomných ve vzorcích –Musí být přibližně stejně dlouhá • • Osvědčené postupy •Bacterial PCR free reagencie, zejména voda •Dekontaminace reagencií – zbavení se bakteriální DNA, zejména u master mixu pro PCR •Alikvotace všech reagencií (po otevření rychle dochází ke kontaminacím) •Oddělení prostor •Vysoký standard úklidu a používání prostředku pro eliminaci DNA jak na površích, tak uvnitř boxů apod. •Vše otevírat až v boxu •Nikdy nevyndávat věci z boxu a zase je vracet •Před otevřením jakékoliv zkumavky stočit (aerosol na víčku) • Kontrolní minimum •Negativní kontrola extrakce •DNA pozitivní kontrola klasická – mock komunita •Doporučení: –interrun kontrola –Negativní kontrola přípravy knihovny (PCR, nejenom ji udělat, to se předpokladá vždy, ale i osekvenovat) Vzorky s nízkou náloží bakteriální DNA •Náročný experimentální design, nutno promyslet dopředu zavedení všech kontrol a jejich počet •Počet kontrol je na zvážení, výrazně prodražuje experiment – je potřeba na to myslet již v žádosti o grant apod. •Je potřeba počítat s tím, že bude potřeba hodně vzorků vyřadit z analýzy, protože nebude rozdíl mezi vzorkem a negativní kontrolou •Vyžaduje náročnou optimalizaci procesů a zvýšený standard práce à zvýšené náklady •Ideální je i pracovat s kity, které jsou bacterial DNA free à zvýšené náklady Máme spoustu kontrol a co pak s tím? •Porovnáním kontrol a vzorků se zjistí množství kontaminace, problematické je, že se může u každého batche vzorků lišit (dle data, personálu, lotu..). •V případě zjištění limitu detekce pomocí pozitivních kontrol lze vypočítat jaké vzorky vyřadit. •Kontaminující taxa se sice doporučuje vyřadit, ale ne vždy je to jednoduché, protože mohou být i přirozeně ve vzorku. Navíc při větším množství negativních kontrol je těchto taxonů detekováno velké množství a jsou variabilní. •Kontaminující taxa se mohou pouze reportovat a opatrně interpretovat, když jsou to zároveň taxa signifikantní ve statistických analýzách. •Existují bioinformatické nástroje, které upravují data podle výsledků kontrol (je potřeba dopředu si promyslet, zda chci nějaký tento nástroj použít a přizpůsobit tomu výběr kontrol) nebo využívají bioinformatického modelování. Nástroje se značně liší v přísnosti, která taxa odstraňují a která ne. •Nastavení jakýchkoliv cutoffů je náročné a nejsou jasná pravidla. •