KALORIMETRIE BIOMOLEKUL Experimentální metody biofyziky F9070 Ctirad Hofr LifeB - Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul FGP - Funkční genomika a proteomika NCBR - Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita íiun SCI Národní centrum pro výzkum biomolekul Jaký je původ všech slov? Kalorimetrie Biokalorimetrie calor = teplo metri = měřit Lavoisier surrounded the animal with an ice-filled jacket. Antoine Laurent Lavoisier (1743-1794) An outer ice-filled jacket intercepted environmental heat. Ice melted by animal heat yielded liquid water, whi c h d ri pped out of the apparatus for collection and measurement. Kalorimetrie biopolymerů Cílem je měření termodynamických parametrů AH, AS, AG u molekulárních procesů Jejich znalost umožňuje nahlédnout pod pokličku regulace průběhu reakce z termodynamického hlediska 4 Popis termodynamické stability DNA Entalpie H AH=q ; (p = konst.) - vytváření, zánik nebo deformace vazeb Entropie S AS=- rev - změna uspořádanosti systému AG = AH- TAS Volná energie AG a rovnovážná konstanta K AG = -RTlnK AG — „ RT K = e G(reaktanty) rovnováha r(produkty) AG rozsah reakce % 6 1 cal 4.184 J 7 Poměrná velikost nekovalentních interakcí Typ interakce Ion-ion Stacking Vodíkové můstky kcal moľ1 kj mol 14.0 58.6 5.0 20.9 1.3 5.4 8 Denaturace proteinu l-a [N] + [D] (kJ) (kcan AG/RT K a _ 7.43 1.78 3 0.05 0.047 4.95 1.18 2 0.135 0.119 2.48 0.59 1 0.368 0.269 0 0 0_1 0.5 -2.48 -0.59 -1 2.718 0.731 -4.95 -1.18 -2 7.389 0.881 -7.43 -1.78 -3 20.09 0.953 Diferenční skenovací kalorimetrie DSC Veličiny získané z měření DSC Termogram Teplota 11 Teplota tání Tm Změna entalpie AH AH =JACprfr Změna entropie AS fACD AS=\^TdT Volná energie AG AG = AH- TAS Použití DSC pro stanovení vlivu kovalentní vazby ligandu na termodynamickou stabilitu DNA Izotermální Titrační Kalorimetrie (ITC) http ://www. voutu be .co m/watch ?v=cYi 510 E La VI Veličiny získané z jednoho měření ITC Time (min) -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 -100 -120 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 innnnnnnnnnnnnr i 1 i 1 i 1 i i i i i i i i i i i i ■ ' ■ AH = -108 kcal moľ1 - AS = -317 cal K"1 moľ1 - ^ K = 1.63 1 07 f N = 0.25 (DNA : protein« AH - Ka Ak - K ..J________ r / i 1.......'i ■ . i 1 1 i —I I I I 1 1 I I—p I I I I I I 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Molar ratio [DNA:protein] Vazebná entalpie AH Stechiometrie N Vazebná konstanta K. Volná energie AG vypočtena z AG = -RTlnKa Změna entropie AS vypočtena z AG = AH - TAS Děje měřitelné na ITC Kcal Mole Injectant 0.0. M.L c = KaMtotN c=500 Ü.0 X TOT 5 < c <500M TOT M - makromolekula, L -Ligand Mtot celková koncentrace makromolekuly Ka vazebná konstanta N stechiometrie interakce Př. M tot = 10"5M pak je měřitelný rozsah vazebné konstanty Ka = 106 až108 M"1 KD = 10"6 až10"8M- KD ~ (iM - nM in 16 Použití ITC při navrhování léčiv Zlepšení farmakokinetických vlastností léčiva lze dosáhnout jeho navázáním na molekulový nosič Po podání komplexu nosiče a léčiva dochází k cílenému transportu na místo účinku, kde dochází k uvolňování léčiva cyklodextrin léčivo komplex Cyklodextriny jsou v přírodě se vyskytující cyklické oligosacharidy Cyklodextrinové nosiče jsou v současnosti testovány při vývoji nových léčiv proti malárii, rakovině a zánětům 17 Termodynamické parametry popisující stabilitu dvoušroubovice DNA v závislosti na teplotě Výpočet termodynamické stability DNA z primární sekvence Model nejbližšího souseda předpokládá, že termodynamická stabilita dvoušroubovice DNA závisí na typu a orientaci sousedních párů bazí. velký žlábek Stabilita dvoušroubovice je pak předpovězena pouze na základě primární sekvence, jestliže je známá relativní termodynamická stabilita každého typu interakcí dvou sousedních párů bazí 19 Termodynamické parametry pro výpočet stability dvoušroubovice DNA 5' AT GC 5 AG/CT Sequence Breslauer et al.5 SantaLucia6 Allawi & SantaLucia7 Sugimoto et al.8 AH AS AH AS AH AS AH AS AA/TT -9.1 -24.0 -8.4 -23.6 -7.9 -22.2 -8.0 -21.9 AG/CT -7.8 -20.8 -6.1 -16.1 -7.8 -21.0 -6.6 -16.4 AT/AT -8.6 -23.9 -6.5 -18.8 -7.2 -20.4 -5.6 -15.2 AC/GT -6.5 -17.3 -8.6 -23.0 -8.4 -22.4 -9.4 -25.5 GA/TC -5.6 -13.5 -7.7 -20.3 -8.2 -22.2 -8.8 -23.5 GG/CC -11.0 -26.6 -6.7 -15.6 -8.0 -19.9 -10.9 -28.4 GC/GC -11.1 -26.7 -11.1 -28.4 -9.8 -24.4 -10.5 -26.4 TA/TA -6.0 -16.9 -6.3 -18.5 -7.2 -21.3 -6.6 -18.4 TG/CA -5.8 -12.9 -7.4 -19.3 -8.5 -22.7 -8.2 -21.0 CG/CG -11.9 -27.8 -10.1 -25.5 -10.6 -27.2 -11.8 -29.0 Initiation with one or two G- C 0.0 -20.1 0.0 -5.9 - - 0.6 -9.0 Initiation with A - T only 0.0 -16.8 0.0 -9.0 - - 0.6 -9.0 Symmetry correction 0.0 -1.3 0.0 -1.4 0.0 -1.4 0.0 -1.4 5' T-A correction - 0.4 0.0 - - - - A-T base pair end - - - - 2.3 4.1 - - G- C base pair end - 0.1 -2.8 20 Výpočet entalpie tvorby dvoušroubovice DNA -46.0 -38.1 -38.1 -46.0 \ \ \ \ 5'G G A A T T C C 3' 3'C C. T T. A A .G G 5' T T t -23.4 -36.0 -23.4 AHcei = (2 x GG/CC) + (2 xGA/TC) + (2 x TC/GA) + (1 x AT/AT) AHcel= (2 x -46.0) + (2 x-38.1) + (2 x -23.4) + (1 x -36.0) AHca = -251 kj mol1 Van t Hoffova rovnice d\nK AH 8(1/T) R Jacobus Vant Hoff (1852-1911) Nobelova cena 1901 l/T smernice = AH R VR pro tání DNA: 1 T m R , „ AS-ln4R -In CTot +- AH Tot AH 22 Spektroskopické sledování tání DNA 40 60 teplota (°C) 23 0 20 40 60 80 100 teplota (°C) Využívá se hyperchromického efektu DNA: Po oddělení komplementárních řetězců se zvýší absorbance při 260 nm Ze závislosti lze určit Tm výpočtem jako hodnotu T, při které je první derivace maximální, nebo graficky jako hodnotu T, ve které se protíná křivka tání a osa směrnic počátku a konce křivky tání. Praktické určení DHVH 20 40 60 teplota (°C) 80 100 AS - ln 4R AH smernice = AH R InC tot T m R , ^ &S-\n4R -ln CTot +- AH AH m Při zvyšování koncentrace DNA dochází ke zvyšování teploty tání Tr Ze směrnice závislosti reciproké hodnoty Tmna celkové koncentraci řetězců se určí AH z průsečíku závislosti s osou 1/Tm se určí AS a vypočte se AG. 24 Vztah mezi AHvH a AH Cal AHvH závislá na modelu - předpokládá dvoustavové chování AHCal přímo a nezávisle určená velikost AHvH ~ AHCul dvoustavový proces při tání se systém nachází v „mezistavech" poměr AHvH/AHCal definuje velikost kooperativní jednotky 25 Obecné odvození Van t Hoffovy rovnice ôlnK AH ÔT RT AG = -RT\nK ^- = ^-AS T T AH =0 = Q = jCPdT, AS = ^ = \C] J3_ dT T 1 d T2 d{\IT) T dT 26 Odvození VR pro vznik dvoušroubovice DNA 1 R , AS-Rln4 — =--lnCro. + - T AH Tot AH m s, + duplex-D AG = -RT\nK K = AG = AH- TAS [D] [SA[S2] Ctot -celková koncentrace obou řetězců Pro T= Tm: [S1]=[S2]=[D]=Ct0/4 KTm= ? 28 Výpočet teploty tání DNA T = 1 m AH AS + R ln C tot ) - 273.15 + 16.61og[Aía+] Př.: GGAATTCC A//=-251 kJ AS = -686 J K-'mol"1 CTot=5 jaM. [Na+]=1M T„= 45.6 °C Zajímavé odkazy Oligonucleotide Properties Calculator http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html *. f"--* f — li \rn* III Mlrhfc A JJ^/ X Ol I ÍJG And tyZC T INTEGRA TED DNA TECHNOLOGIES http://eu.idtdna.com/analvzer/Applications/OliqoAnalyzer/ Biophysical Society http://www.biophysics.org/Education/WhatisBiophysics/tabid/2287/Default.aspx 31