Ctirad Hofr LifeB – Laboratoř interakce a funkce esenciálních Biomolekul Experimentální metody biofyziky F9070 FGP – Funkční genomika a proteomika NCBR – Národní centrum výzkumu biomolekul Přírodovědecká fakulta | Masarykova univerzita Kapalinová chromatografie proteinů a DNA Přehled přednášky Princip chromatografie Základní součásti chromatografu Druhy kapalinové chromatografie Příklady použití Princip chromatografie Molekuly se rozdělují – přecházejí mezi stacionární a mobilní fází, čímž je dosaženo rozdělení molekul. Základní části chromatografu Chromatograf – přístroj sloužící k separaci složek vzorku Mobilní fáze – neboli eluent, je fáze pohybující se chromatografickým systémem. Tato fáze přivádí vzorek do stacionární fáze, kde dochází k jeho separaci Stacionární fáze – je fáze ukotvená na místě zpravidla ve formě kolony, přes kterou prochází mobilní fáze a také složky vzorku. Zde dochází k separaci v důsledku distribuce vzorku mezi stacionární a mobilní fázi Chromatografická separace – rozdělení vzorku na jednotlivé složky (analyty) na základě rozdílné distribuce mezi mobilní a stacionární fázi Retenční čas – čas, který složka potřebuje k průchodu chromatografickým systémem Chromatogram – záznam z chromatografu znázorňující jednotlivé analyty nejčastěji ve formě tzv. chromatografických píků oddělených navzájem základní linií Preparativní chromatografie – slouží k izolaci čistých nebo alespoň čistějších složek vzorku, které jsou dále použity k chemické reakci, další separaci apod. Autosampler - automaticky dávkuje vzorky do přístroje Frakční kolektor – sbírá eluent po průchodu kolonou Druhy kapalinové chromatografie 1. Afinitní chromatografie 2. Iontoměničová chromatografie 3. Hydrofobní interakce 4. Gelová chromatografie 5. Reverzní fáze 1. Afinitní chromatografie https://youtu.be/ezj9MVGCf8c?si=gv4m-Ivda8gqDEef https://youtu.be/ezj9MVGCf8c?si=gv4m-Ivda8gqDEef IMAC – Immobilized Metal ion Affinity Chromatography Výsledek obrázku pro imidazole • Založena na koordinační vazbě mezi histidinem a kovy – Co, Ni, Cu • Používá se pro purifikaci proteinů s rekombinačně vloženým “His-tag” • Pro eluci navázaného proteinu se používá zpravidla přidání imidazolu jako kompetitoru k His nebo změna pH z 8 na 5 • Vazebná kapacita přibližně 10 mg proteinu/mL sorbentu Příklad použití afinitní chromatografie Rychlá a účinná izolace proteinu z buněčného extraktu. Obvykle první krok při purifikaci proteinu. Recombinant Protein Purification Principles and Methods 2. Iontoměničová chromatografie https://youtu.be/tqianb7AvnU?si=pasEFtlA7jVgmPDdt=26 https://youtu.be/tqianb7AvnU?si=pasEFtlA7jVgmPDd&t=26 Použití Ionex chromatografie pro purifikaci DNA Separace a purifikace oligonukleotidů 3. Hydrofobní interakce https://www.youtube.com/watch?v=d8P04atG9Fs https://www.youtube.com/watch?v=d8P04atG9Fs 3. Hydrofobní interakce https://youtu.be/aqO-p8terxY?si=i7SPwy7U7jMN0MEW https://youtu.be/aqO-p8terxY?si=i7SPwy7U7jMN0MEW 4. Gelová – Size Exclusion Chromatography SEC https://youtu.be/aWtThd13I4I?si=LoBZ-kuVF3PzQzWB https://youtu.be/aWtThd13I4I?si=LoBZ-kuVF3PzQzWB Retenční čas se s množstvím vzorku zkracuje 5. Normální a reverzní fáze https://youtu.be/MLoitPJQH3g?si=NuyBE81nkZq6_LAK https://youtu.be/MLoitPJQH3g?si=NuyBE81nkZq6_LAK 5. Reverzní fáze HEPARIN - afinitní a iontoměničová chromatografie v jednom Heparin se podobá vlastnostmi DNA => afinita DNA vazebných proteinů pufr A: 10 mM TRIS-HCl (7.5) 200 mM NaCl pufr B: pufr A + 800 mM NaCl; průtok 1ml/min 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 70 t (min) ABS(280) Vodivost(mS) Příklady purifikace proteinů 1. Purifikace lidského telomerového proteinu hPOT1 laskavě poskytnul Pavel Veverka 2. Purifikace rostlinné telomerázy 1. Purifikace lidského proteinu hPOT1 Hmyzí buňky: Spodoptera frugiperda Blýskavka kukuřičná)Purifikace: • Rozbití buněk sonikátorem • ¨; • Centrifugace -> odstranění nesolubilních částí • Afinitní chromatografie (6xHis tag) • Eluce imidazolem • Odštěpení elučního tagu pomocí HRV3C proteázy • Iontoměničová chromatografie (Heparinová kolonka mimikuje DNA) • Gelová permeační chromatografie • DNA vazebný protein, váže jednořetězcovou telomerickou DNA • Exprese v hmyzích buňkách pomocí bakulovirů • GST tag pro lepší stabilitu a rozpustnost Afinitní chromatografiehPOT1 Afinitní chromatografie 6xHis (sorbent Talon) eluce imidazolem 300 mM Heparin chromatografie Eluce gradientem NaCl (0 - 1 M) Červeně POT1, oranžově odštěpené tagy, zeleně proteáza Heparinová chromatografie hPOT1 DNA vazba (sorbent Heparin) Eluce gradientem NaCl (0 - 1 M) – černá linka na chromatogramu červená linka reprezentuje naměřenou konduktivitu modrá linka reprezentuje naměřenou absorbanci A280 Červeně POT1, oranžově odštěpené tagy, zeleně proteáza Na kolonu se zachytí v nízké soli pouze DNA vazebné proteiny, ostatní protečou. Po eluci drží odštěpený protein zájmu se zbytkem proteázy v nativním komplexu (podle SDS gelu). hPOT1 Gelová permeační chromatografie Superdex 200, 120 mL kolonka Pufr: 50mM Napi, 800mM NaCl, pH 7 Odstranění proteázy (24 kDa) a zbytku expresních tagů (15 kDa). Získávám čistý protein (červená šipka). hPOT1 shrnutí purifikace Vstup: 7,2 g peletu hmyzích buněk s hPOT1 Výstup: 0,017 mg čistého proteinu (V=35uL, c=7,3uM) Časová náročnost: purifikace 13 hodin kontinuální práce krok [mg] Po Eluci 5,23 Po štěpení 5,13 Po heparince 0,84 Před gelovkou 0,27 Zamraženo 0,017 Množštví proteinu v jednotlivých krocích Čím více purifikačních kroků, tím větší ztráty proteinu. 24 2. Purifikace rostlinné telomerázy Centrifugace 25 000 g, 15’, 4°C PEG srážení 10 % PEG 8000, 30’, 4°C Filtrace 0.45 µm DEAE chromatografie Macroprep (BioRad) Zakoncentrování Ultrafiltrace M.W. cut off 100 000 Modified procedure from Fitzgerald et. al. PNAS 1996 Dialýza M.W. cut off 8000 HEPARIN chromatografie HiTRAP (GE) Slabá aniontoměničová chromatografie pufr A: 10 mM TRIS-HCl (7.5) 3 mM KCl 1 mM MgCl 1 mM EGTA 50 mM NaCl pufr B: pufr A + 700 mM NaCl průtok 8 ml/min DEAE dietylaminoetyl Vodivost(mS) 0 0.5 1 0 5 10 15 t (min) ABS(280) Vývoj velikosti používaných kolon Profil po přečištění a další krok Purifikace DEAE chromatografií ?přidat (NH4)2SO4 Hydrofobní odsolení Kationtoměničová 0 2 4 6 8 10 12 14 0,00 0,01 0,02 ABS280 Time (min) 0 50 100 150 Conductivity(mS) 0 1 2 3 4 5 6 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 ABS280 Time (min) 0 50 100 150 Conductivity(mS) Nedostatečné množství výchozího materiálu Před dalším purifikačním krokem bylo nutné zvýšit počáteční množství purifikovaného materiálu => homogenizátor rostlinného materiálu V chromatografii na množství výchozího vzorku velmi záleží! Hmoždířový mlýn aneb automatická třecí miska Zpracování 4 – 100 g materiálu najednou Možnost mletí v tekutém dusíku Výsledná zrnitost ~ 10 m Telomerázová aktivita 170 130 100 70 55 40 35 25 kDa150 bp 100 bp 50 bp SDS PAGE profil Množství materiálu před a po purifikaci Výchozí : mikrokalusová kultura 100 000 mg Hrubý extrakt po srážení PEG: 150 mg Po 1. purifikačním kroku (DEAE): 10 mg Po 2. purifikačním kroku (Heparin): 0.5 mg Užitečné odkazy Principles & Methodology Handbooks Find practical tips and in-depth information about common methodologies used in the lab. https://www.cytivalifesciences.co m/en/us/support/handbooks