Kapalinová chromatografie proteinů a DNA Ctirad Hofr Experimentální metody biofyziky Přehled přednášky •Princip chromatografie •Základní součásti chromatografu •Druhy chromatografie •Příklady použití Princip chromatografie Molekuly se rozdělují mezi stacionární a mobilní fázi, čímž je dosaženo rozdělení molekul. Základní části chromatografu • Chromatograf – přístroj sloužící k separaci složek vzorku • Mobilní fáze – neboli eluent, je fáze pohybující se chromatografickým systémem. Tato fáze přivádí vzorek do stacionární fáze, kde dochází k jeho separaci • Stacionární fáze – je fáze ukotvená na místě zpravidla ve formě kolony, přes kterou prochází mobilní fáze a také složky vzorku. Zde dochází k separaci v důsledku distribuce vzorku mezi stacionární a mobilní fázi • Chromatografická separace – rozdělení vzorku na jednotlivé složky (analyty) na základě rozdílné distribuce mezi mobilní a stacionární fázi • Retenční čas – čas, který složka potřebuje k průchodu chromatografickým systémem • Chromatogram – záznam z chromatografu znázorňující jednotlivé analyty nejčastěji ve formě tzv. chromatografických píků oddělených navzájem základní linií • Preparativní chromatografie – slouží k izolaci čistých alespoň čistějších) složek vzorku, které jsou dále použity (k chemické reakci, další separaci apod.) • Autosampler - automaticky dávkuje vzorky do přístroje • Frakční kolektor – sbírá eluent po průchodu kolonou Druhy kapalinové chromatografie 1. Afinitní chromatografie 2. Iontoměničová chromatografie 3. Hydrofobní interakce 4. Gelová chromatografie 5. Reverzní fáze 1. Afinitní chromatografie https://www.youtube.com/watch?v=ezj9MVGCf8c IMAC chromatografie Immobilized Metal ion Affinity Chromatography • Založena na principu kovalentní vazby mezi histidinem a kovy – Co, Ni, Cu • Používá se pro purifikaci proteinů s rekombinačně vloženým “His-tag” • Pro eluci navázaného proteinu se používá zpravidla přidání imidazolu jako kompetitoru k His nebo změna pH z 8 na 5 • Vazebná kapacita přibližně 10 mg proteinu/mL sorbentu Příklad použití afinitní chromatografie • Rychlá a účinná separace z buněčného extraktu Recombinant Protein Purification Principles and Methods Handbook 2. Iontoměničová chromatografie https://youtu.be/q3fMqgT1do8 Příklady použití Ionex chromatografie pro purifikaci DNA Separace a purifikace oligonukleotidů 3. Hydrofobní interakce https://youtu.be/v6SPK6ZovgA 4. Gelová chromatografie Size Exclusion Chromatography = SEC https://youtu.be/oV5VB5kO3tQ Retenční čas se s množstvím zkracuje 5. Reverzní fáze https://youtu.be/-ajxqELsCFM HEPARIN - afinitní chromatografie Podobá se vlastnostmi DNA => afinita DNA vazebných proteinů 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 70 t (min) ABS(280) Vodivost(mS) pufr A: 10 mM TRIS-HCl (7.5) 200 mM NaCl pufr B: pufr A + 800 mM NaCl; průtok 1ml/min Příklady purifikace proteinů 1. Lidský protein POT1 (Protection Of Telomeres) 2. Purifikace extraktu obsahující aktivní telomerázu Příklad 1 - hPOT1 Hmyzí buňky: Spodoptera frugiperda (Blýskavka kukuřičná) hPOT1-wt Purifikace: • Rozbití buněk sonikátorem • Centrifugace -> odstranění nesolubilních částí • Afinitní chromatografie (skrze 6xHis tag) • Eluce imidazolem • Odštěpení elučního tagu pomocí HRV3C proteázy • Iontoměničová chromatografie (Heparinová kolonka mimikuje DNA) • Gelová permeační chromatografie • DNA vazebný protein, váže jednořetězcovou telomerickou DNA • Exprese v hmyzích buňkách pomocí bakulovirů • GST tag pro lepší stabilitu a rozpustnost Afinitní chromatografie Afinitní chromatografie 6xHis (sorbent Talon) eluce imidazolem Iontoměničová chromatografie DNA vazba (sorbent Heparin) Eluce gradientem NaCl (0 - 1 M) Červeně POT1, oranžově odštěpené tagy, zeleně proteáza Iontoměničová chromatografie DNA vazba (sorbent Heparin) Eluce gradientem NaCl (0 - 1 M) – černá linka na chromatogramu červená linka reprezentuje naměřenou konduktivitu modrá linka reprezentuje naměřenou absorbanci A280 Červeně POT1, oranžově odštěpené tagy, zeleně proteáza Na kolonu se zachytí v nízké soli pouze DNA vazebné proteiny, ostatní protečou. Po eluci drží odštěpený protein zájmu se zbytkem proteázy v nativním komplexu (podle SDS gelu). Gelová chromatografie Superdex 200, 120 mL kolonka Pufr: 50mM Napi, 800mM NaCl, pH 7 Odstranění proteázy (24 kDa) a zbytku expresních tagů (15 kDa). Získávám čistý protein (červená šipka). Kvantitativní zhodnocení purifikace • Vstup: 7,2 g peletu hmyzích buněk s hPOT1 • Výstup: 0,017 mg čistého proteinu (V=35uL, c=7,3uM) • Časová náročnost: purifikace 13 hodin kontinuální práce krok [mg] Po Eluci 5,23 Po štěpení 5,13 Po heparince 0,84 Před gelovkou 0,27 Zamraženo 0,017 Množštví proteinu v jednotlivých krocích Mnoho purifikačních kroků = velké ztráty proteinu. Příklad 2. Purifikace telomerázy - postup Centrifugace 25 000 g, 15’, 4°C PEG srážení 10 % PEG 8000, 30’, 4°C Filtrace 0.45 µm DEAE chromatografie Macroprep (BioRad) Zakoncentrování Ultrafiltrace M.W. cut off 100 000 Modified procedure from Fitzgerald et. al. PNAS 1996 Dialýza M.W. cut off 8000 HEPARIN chromatografie HiTRAP (GE) Příprava dostatečného množství výchozího materiálu Před dalším krokem je nutné zvýšit počáteční množství purifikovaného materiálu => homogenizátor rostlinného materiálu Hmoždířový mlýn RM 100 alias automatická třecí miska • Zpracování 4 – 100 g materiálu najednou • Možnost mletí v tekutém dusíku • Výsledná zrnitost ~ 10 µm Aniontoměničová DEAE chromatografie – slabý náboj pufr A: 10 mM TRIS-HCl (7.5) 3 mM KCl 1 mM MgCl 1 mM EGTA 50 mM NaCl pufr B: pufr A + 700 mM NaCl průtok 8 ml/min DEAE dietylaminoetyl Vodivost(mS) 0 0.5 1 0 5 10 15 t (min) ABS(280) Přehled velikosti používaných kolon Profil po DEAE chromatografii Purifikace DEAE chromatografií ?přidat (NH4)2SO4 Hydrofobní odsolení Kationtoměničová 0 2 4 6 8 10 12 14 0,00 0,01 0,02 ABS280 Time (min) 0 50 100 150 Conductivity(mS) 0 1 2 3 4 5 6 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 ABS280 Time (min) 0 50 100 150 Conductivity(mS) HEPARIN - afinitní chromatografie Podobá se vlastnostmi DNA => afinita DNA vazebných proteinů 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 70 t (min) ABS(280) Vodivost(mS) pufr A: 10 mM TRIS-HCl (7.5) 200 mM NaCl pufr B: pufr A + 800 mM NaCl; průtok 1ml/min Telomerázová aktivita 170 130 100 70 55 40 35 25 kDa150 bp 100 bp 50 bp SDS PAGE profil Přehled množství materiálu Výchozí : mikrokalusová kultura 100 g Hrubý extrakt po srážení PEG: 150 mg Po 1. purifikačním kroku (DEAE): 10 mg Po 2. purifikačním kroku (Heparin): 0.5 mg Literatura •Protein purification: types •Affinity Chromatography - Vol. 1: Antibodies •Affinity Chromatography - Vol. 2: Tagged Proteins •Affinity Chromatography - Vol. 3: Specific Groups of Biomolecules •Hydrophobic Interaction Chromatography •Ion Exchange Chromatography •Multimodal Chromatography •Size Exclusion Chromatography •Protein purification: strategies •ÄKTA Laboratory-Scale Chromatography Systems •Cross Flow Filtration Method Handbook •Design of Experiments in Protein Production and Purification •GST Gene Fusion System •High Throughput Process Development (HTPD) with PreDictor Plates •Purifying Challenging Proteins •Strategies for Protein Purification •Protein analysis •2-D Electrophoresis •Biacore Assay Handbook •Biacore Sensor Surface Handbook •Molecular Imaging •Western Blotting •Protein sample preparation •Cross Flow Filtration Method Handbook •Protein Sample Preparation •Cells •Cell Separation Media (Density Gradient Centrifugation Media) •Cross Flow Filtration Method Handbook •Microcarrier Cell Culture •Isolation of Mononuclear Cells •Nucleic acids •Biacore Assay Handbook •Biacore Sensor Surface Handbook •Cross Flow Filtration Method Handbook •GST Gene Fusion System •Molecular Imaging •Nucleic Acid Sample Preparation for Downstream Analyses •Size Exclusion Chromatography