Rentgenová strukturní analýza Experimentální metody biofyziky muni SCI National Centre for Biomolecular Research Tom Brom 19. 11. 2023 Lifeb Rentgenová Krystalografie Rozptyl světla na elektronech • Fotoapsorbce elektronu • Foton absorbován • Neelastický rozptyl •Modifikovaná frekvence a fáze • Elastický rozptyl •NENÍ modifikovaná fáze ani frekvence •"Rayleigh scattering" nebo "Thomson scattering" Q_ Rentgenová Krystalografie Goniometrické funkce Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Braggův zákon Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Difrakce na mřížce Vypočítejte d (parametr mřížky). Difrakce na mřížce Vypočítejte d (parametr mřížky). Zelený laser Vypočítejte d (parametr mřížky) A = 532nm XI = ... cm Zelený laser Vypočítejte d (parametr mři X = 532nm tg(2G) = XI/Y 26 = tg-^XI/Y) 29 = ..." 6 — ...0 Zelený laser Vypočítejte d (parametr mřížky) A = 532nm tg(29) = XT/Y 29 = tg-^XI/Y) 29 = ..." 6 — ...0 2d sinO = nA d = nA/2 sinO d = ...*... /2 * sin(...) d = ... nm d = ... \im Principles of Protein Crystallization ► G>B®ffB0KI8 Real video: https://youtu.be/kPX6-Ab1 pYw?si=dFBcu3qhfE-17EdU 24 Temperature Protein Solution Protein Crystal Diffraction Data Rentgenová Krystalografie Protein Cone, x 1/2 Precipitant Cone, x 1/2 Vol. x 2 500ML REAGENT |-2ML PROTEIN Rentgenová Krystalografie zový diagram krystalizace Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Rentgenová Krystalografie Arganduv diagram A = \A\ (cos a + i sin a) imaginary axis A sin a ^ A 1 ^ \ a 1 real axis A COS a A — \A \ exp ia Arganduv diagram A — \A \ (cos a + i sin a) imaginary axis A sin a A — \A \ exp ia F(hki)= \F(hki)\(cos a{hkl) + isina(hkl)) F(hki)= \F(hki)\exp[ia(hkl)] Argandův diagram A = \A \ (cos a + i sin a) A = \A \ exp ia F(hki)= \FQiki)\(cos a{hkl) + isina(hkl)) pQikl) - \F(hkl)\exP[ia(hkl)] P(xyz) = X X I^OWkol exP [-2*Khx + ky + Iz) + la(hkl)] h k I FT složené funkce f4 f4=f1 +f2+f3 FT složené funkce f4 f4=f1 +f2+f3 P{xyz) = X X lF(^)l exP [-2ni(kx + ky + Iz) + ia{hkt)] h k i Elektronová hustota 1 N P(X) = y ^ l^jfil exp [-2ni hx + iam] n-l Metody řešení fázového problému •Metoda molekulárního nahrazení • Metoda izomorfního nahrazení • Metoda anomálního rozptylu crystal diffraction pattern electron density map atomic model x-rays phases refinement Fourierova transformace obrázku CT) O CO >s > O OJ CT) C OJ o: # # Fourier Transform 227-Telomerase [_Image 4_ ^ I_ image 3 Cell parameters Mask Draw Transform Image Show Color ref O Periodicity Circular Size 10 2 -+ FFT Zoom O Complex a 80 C b 60 C Rectangular Width 350 2 Color 100 2 FFT-1 «- Contrast Real part m alpha 90 2 Height 350 C « B Imaginary part Angle 90 2 ( Advanced ) Mask Magnitude2 Place cell Place mask Clear Re= 0.0 lm=0.0 A=0.0 cp =0° Phase -- l - - Odkaz program ZDE je potřeba mítjava na PC Real space cat Fourier transform Fourier amplitudes and phases Fourier cat Circular rainbow scale of phases Linear intensity scale of amplitude size Observed amplitudes Unknown structure, unknown orientation Cat Known structure Manx cat Diffraction experiment Diffracted 1* Fourier transform Observed amplitudes Phases unknown! Fourier cat Calculated amplitudes and phases FT of Manx cat Wrong orientation! Observed amplitudes (tailed cat), calculated pha es (Manx cat) Inverted Fourier transform Even the tail becomes visibl Model Bias Duck Duck amplitudes + cat phases Fourier transform Inverted Fourier transform Fourier transform of duck 4 Looks like a cat!! 4 Rozlišení modelu • Proteinové struktury mívají mezi 1 -2 Ä • Flexibilní části často nejsou pozorovatelné £, astex R-factor a Rfree factor - ovefeni Film X-ray tube X-ray beam Observed reflections Model Calculated diffraction pattern R-factor J]l|Fobs|-^|Fcalc|| R = hkl hkl Rfree factor ^free — /] ll^obsl _ fcl^cakll E l^bsl Výpočet struktury z náhodných fází Original structure Reconstructed structure CD O -03 > O OJ CD C OJ q: Draw a Structure FFT t FFT-1 Flip charges Random c , Phases \^ (p< i) Restore amplitudes 9 Help ICR S CM sú 2DSÍ — Total Charge C(0> — R factor □ rawing Pen size 10 Z Darkness 100 C Position: -109 95 Ciear Run FFT Do one cycle Loop Reset Parameters Q Mask Radius Delta 0.4279 C Q Dynamic 10 C X Weak reflections 0_10.1 % Default Re=0.0 lm=0.0 A=0.0 cp=0° Image Zoom Contrast Rotate 180° Show O Complex Real part Imaginary part Magnitude2 Phase Color ref Odkaz program ZDE je potřeba mít Java na PC No crystal - No problem Small-angle X-ray scattering SAXS Maloúhlý rozptyl rentgenového světla Maloúhlý rozptyl rentgenového světla XRD detector image diffarction spots SAXS detector image x-ray scattering Subtracted SAXS data CD O > O OJ CD C OJ q: A B 0 00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0123456789 10 q2 (nm"2) r (nm) | 5g Shrnutí krystalografie