Karel Souček Biofyzikální ústav AV ČR, Masarykova Univerzita, FNUSA-ICRC Průtoková cytometrie Dva běžné způsoby, jak zjistit celkový počet, typ a funkci buněk ve vzorku Mikroskopie Poskytuje podrobnosti o morfologii buněk pro desítky nebo stovky buněk. Může poskytnout informace o buněčných interakcích a funkcích. + tvar + distribuce komponent uvnitř buněk Průtoková cytometrie Kvantifikuje vysoký počet parametrů u stovek nebo tisíců buněk za sekundu v suspenzi a je možný sorting/separace živých buněk + velikost a granularita + povrchové a intracelulární komponenty Cytometrie Cytometrie je souhrnné označení pro skupinu metod používaných pro měření různých charakteristik buněk. Proměnné, které lze měřit cytometrickými metodami, zahrnují velikost buňky, počet buněk, morfologii buněk (tvar a strukturu), fáze buněčného cyklu, obsah DNA a přítomnost či nepřítomnost specifických proteinů na buněčném povrchu nebo v cytoplazmě. Cytometrie se používá k charakterizaci a počítání krevních buněk v běžných krevních testech, jako je úplný krevní obraz. Podobným způsobem se cytometrie také používá ve výzkumu buněčné biologie a v lékařské diagnostice (například k odhalování rakoviny či AIDS). Průtoková cytometrie Spektrální průtoková cytometrie Hyperspektrální cytometrie Obrazová cytometrie Hmotnostní cytometrie Cytometrie in vivo 1965 ----> 2022/23 1965 ----> 2022/23 Komerční zařízení a vývoj Buněčné znaky Buněčné znaky Buněčné znaky Buněčné znaky Co je průtokový cytometr? Signal processing time analogsignalintesity VOLTAGE FSC ~ cell size FL-1 (530/30nm) ~ green fluo. FL-2 (585/42nm) ~ red fluo. Analog/digital conversion Height Width Area ( ∫ ) FL- (H, W, A) FL-1(H) FL-2 (H) dot plot 0 1000 1000 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? Počítat částice v suspenzi Oddělit živé částice od neživých Hodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu Kvantifikovat rozptyl světla, a intenzitu fluorescence pro jednotlivé buňky (částice) Fyzicky separovat jednotlivé částice (populace) pro další analýzu Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 new automatic cell cloning assay (ACCA) for determination of clonogenic capacity of CSCs single cell/well up to 384 well plate re-culture after sorting (2D, 3D) analysis: CyQuant, ATP, xCelligence, microscopy Stain-iT Jaké jsou principy? ◼ Rozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru nebo UV lampy ◼ Detekce/kvantifikace specifické fluorescence ◼ Hydrodynamicky zaostřený proud částic ◼ Elektrostatická separace částic ◼ Možnost multivariační analýzy dat Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Rozptyl světla Hmota rozptyluje světlo vlnových délek které není schopna absorbovat Viditelné spektrum je 350-850 nm proto malé částice a molekuly (< 1/10 ) spíše viditelné světlo rozptylují Pro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi směry Rozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém dopadá světlo na ozářenou částici  na tomto principu je založeno měření velikosti částic pomocí průtokového cytometru Shapiro p.106Shapiro p.106http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html Fluorescenční spektra Fluorescenční proces je cyklický. Kromě fluorochromu nevratně zničeného (photobleaching - „vysvícení“) může být opakovaně excitován. Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX 1, EX 2, EX 3) does not change the emission profile but does produce variations in fluorescenceemission intensity (EM 1, EM 2, EM 3) that correspond to the amplitude of the excitation spectrum. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Detekce fluorescence Vybavení pro fluorescenci (1) zdroj excitace (2) fluorochrom (3) vlnové filtry pro izolaci emitovaných fotonů od excitovaných (4) detektory pro registraci emitovaných fotonů Fluorescenční přístroje - spektrofluorometer měří průměrné vlastnosti objemu vzorku v kyvetě. - fluorescenční mikroskop popisuje fluorescenci jako jev v prostorovém systému souřadnic - flow cytometer měří fluorescenci v proudícím toku, umožňuje detekovat a kvantivikovat subpopulace uvnitř velkého vzorku Fluorescenční signál - spektrofluorometer je flexibilní, umožňuje měřit v kontinuálním spektru excitačních a emisních vlnových délek - flow cytometr potřebuje fluorescenční značky excitovatelné určitou vlnovou délkou. Fluorescence pozadí - endogení složky - autofluorescence - nenávazané nebo nespecificky vázané značky = reagenční pozadí Vícebarevné značení - dvě a více značek, zároveň monitoruje různé funkce - nutné: vhodně zvolit značky zdroj excitace a separační filtry K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescence Output of Fluorophores Comparing Different Dyes F-actin ~ BODIPY FL phallacidin anti-ß tubulin ~ Texas Red goat anti–mouse IgG DNA ~ DAPI Mouse 3T3  Hind III propidium iodide K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Technické součásti ◼Zdroje světla ◼Detekční systémy ◼Fluidní systém ◼Separace ◼Sběr dat ◼Analýza dat J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Technické součásti ◼Detekční systémy Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs)) dříve 1-2 nyní >8 Diody dříve detekce rozptylu světla (light scatters) nyní i detekce fluorescence ◼Zdroje světla Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag UV (Arc) Lampy Mercury, Mercury-Xenon J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Způsoby pro zobrazení dat Nástroje pro analýzu dat • Výrobci HW • Beckman Coulter • Kaluza • Becton Dickinson • FACSDiva • FACSSuite • FlowJo • BioRad • Sony • Milteney • … • Univerzální platformy • Komerční • FlowJo • FCS Express • … • Freeware • Flowing Software • Cyflogic • BioConductor - Flowcore Vizualizace dat a intepretace dat Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR (2006) Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol 7: 681-685 Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR (2006) Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol 7: 681-685 Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 color 4 color 5 color Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ upraveno podle J.P.Robinson https://docs.flowjo.com/flowjo/advanced-features/dimensionality-reduction/tsne/ Cell cycle and proliferation Approaches Cell cycle analysis DNA synthesis analysis Buněčný cyklus d:\powerpoint\figures\chapter17\1708.jpg http://i.imgur.com/iq9cbSw.jpg • One of the oldes application of flow cytometry, analysis of the cells in cell cycle phases based on the quantification of DNA • flow cytometry is convenient method for quick and relatively precise determination of cell cycle • DNA is simply labeled using fluorescent dye specific for DNA • Propidium iodide • 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - fluorescence increases after binding to DNA. Membranes have to be permeabilized. • Hoechst 33342 • Vybrant® DyeCycle • DRAQ5 • Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - labeling of live cells (possible cytotoxicity) Cell cycle analysis G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0G1 s G2M DNA Analysis DNA content C o u n t 2N 4N Normal Cell CycleNormal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Analysis of synchronized cells Analysis if BrdU incorporationAnalysis if BrdU incorporation ◼ Bromodeoxyuridin (BrdU) is incorporated into DNA instead of thymidine during S-phase ◼ BrdU is detected using specific antibody after the fixation and partial denaturation of DNA (acid, DNAse) ◼ DNA can be stained in the last step Analysis if BrdU incorporationAnalysis if BrdU incorporation File: HL60 K/24h Region % Gated R1 100.00 R2 35.48 R3 10.25 R4 47.87 R5 1.32 R4 R2 R3 R5 Click azide/alkyne reaction Invitrogen Carolyn R. Bertozzi, Morten Meldal and Barry Sharples Click-IT (Invitrogen) applications analysis of DNA synthesis (EdU - 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) Tritiated (3H) thymidine 3H-thymidine • Original method for measuring cell proliferation • Radioactive • Not compatible for multiplexed analyses 3H-thymidine BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) BrdU Br Br Br Br Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU • Non-radioactive • Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-BrdU access, can affect: • Ability for other antibodies to bind • Morphology • Ability for dyes that require dsDNA to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Click-iT EdU Click-iT EdU Click-iT Edu • Non-radioactive • No DNA denaturation required • Simplified protocol • Small molecule detection • Multiplex compatible, including • Other antibodies • Dyes for cell cycle analysis Flow cytometry most common application Viability assays (propidium iodid, CalceinAM, …) Proliferation (BrdU, EdU, mitosis - pH3) DNA damage ( yH2AX,…) Cell Death analysis (AnnexinV, Cleaved Caspase3, …) Cell Cylcle (DNA content, Cell cycle modulation after treatment) Immunophenotype characterisation of the cells (CSCs markers, differentiation, …) The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescent proteins bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - jellyfish Blue bioluminescence. Ca2+ interacts with aequorin photoprotein. Blue light excites green fluorescent protein. Renilla reniformis – coral luminescence appears after degradation of coelenterazine in the presence of luciferase enzyme. Blue light excites green fluorescent protein Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescent proteins http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Roger Tsien ~ 2002 – mutated FP = wide spectrum of colors http://www.tsienlab.ucsd.edu/ Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Analysis of synchronized cells Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Nature Methods - 5, 283 (2008) Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 S, G2, M- SCFSkp2 Fucci http://cfds.brain.riken.jp/Fucci.html CONTROL SCH900776 MU380VEHICLEGEMCITABINE Summary DNA analysis Require fine sample preparation, debris elimination, sw tool for precise analysis of histograms It is possible to combine with analysis of other parameters e.g. DNA synthesis Fluorescent proteins Fucci – elegant tool for in vitro a in vivo experiments Trendy: instrumentace Spectral flow cytometry J.P. Robinson, Purdue University Spectral flow cytometry Conventional vs. spectral analysis Personální systémy Flow cytometrie a analýza obrazu ThermoFisherScientific: Attune CytPix Flow Cytometer BD FACSDiscover S8 SCIENCE 20 Jan 2022 Vol 375, Issue 6578 pp. 315-320 DOI: 10.1126/science.abj3013 Trendy: Reagencie PrimeFlow RNA Assay Briliant Violet polymers https://www.csac.cz K čemu to všechno je… například… https://www.nature.com/naturecareers/jobs/?Keywords=flow+cytometry#browsing Shrnutí přednášky průtoková cytometrie: nabízí široké spektrum aplikací; rychlý způsob analýzy a separace heterogenních populací; separace populací; multiparametrické analýzy.