Financováno Evropskou unií NextGenerationEU Národní plán obnovy MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY POLYMERAZOVA ŘETĚZOVÁ REAKCE Miloslava Fojtova Molekulární komplexy chromatinu, Mendlovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, CEITEC MU Národní centrum pro výzkum biomolekul, PřF MU f ojtova@sci. m u n i. cz U NI Central European Institute of Technology BRNO I CZECH REPUBLIC SCI NPO-4 Pokročilé metody v genomice a proteomice, NPO_MUNI_MSMT-16606/2022 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE Rvchlé namnožení úseku DNA na orincipu in vitro replikace DNA. 5-AGTCT ATGTGTGAGTCT ATGTGTG-3' Denaturace 5-AGTCT ATGTGTGAGTCT ATGTGTG-3' 3'-TCAGATACACACTC A G AT A C A C A C-5' Vznik jednoretězcových molekul DNA 5'-AGTCT ATGTGTGAG TCT ATGTGT G-3' 3-TC AGA TACACACTC A G A T A C A C A C-5' Posedáni primerů i 5-AGTCTATGTGTGAGTCTATGTGTG-3' AC ACAC-5' 5 -AG T C T A 3-TCAGATACACACTC AGATACACA C-5' Syntéza DNA 5'-AGTCT ATGTGTGAGTCT ATGTGTG-3' ^sr""DW' AC ACAC-5' S'-AGTCTA^ 3'-TC AG AT AC ACACTC AG A T ACACAC-5' Vznik dvouvlaknové molekuly DNA 5-AGTCT ATGTGTGAGTCT ATGTGTG-3' 3-TC AGA TACACACTC AGA TACACAC.5- 1983 - Karry Mullis (1944-2019) (Cetus Corporation) 1993 - Nobelova cena za chemii dostupné na: https://labquide.cz/metodv/pcr/ [vid 13.6.2023] < cl co cd k> o l\d co c7 co c7 ro c7 c7 cd cd cd 00 o cd co cd w o —* —s cd 3 c/5 cd 03 čô' o c. =7 =3 Cl CO cd' =3 w < po enl o =3 i\5 92. o CD o cr o cd co —1. I\d cd —* cd cd 03 CO CD cd cd é l\d cp & cr cd o cl o 1l ke —L Cl CD cd cl i =3 03 3 D f ° c/5 rt-> t3 g CD> S =» g Pí w 3- =3' Q o =3 o w b o o o 92. o o; —s cd' 03 zla co cd k> o l\d co f ° c/5 rt-> t3 S =» ^ P? 03 —* < 3 c_ b o 3 o o 5) CO NAPIPETUJEME DO MIKROZKUMAVKY • Termostabilni DNA polymeraza 5 i i i i i i i i i I i i i rr ggttacc attca 3' c c a a t c 3' I I I I I I cta ta ac tcatg i i i i i i i i i i i i i i i 5' DNA polymerase dostupne na: https://coursesJumenlearninq.corn/wrn-bioloqy1/ chapter/readinq-proofreadinq-dna/ [vid 13.6.2023] enzym organismus (opt. teplota) Taq Thermus aquaticus (65-70 °C) Tth Thermus thermophylus (65 °C) Pfu Pyrococcus furiosus (100 °C) CO NAPIPETUJEME DO MIKROZKUMAVKY Oligonukleotidové primery 5' ATATCGTTGCCTAGTGGTATCGTAAT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3, DNA templet 3' AG CA T TA • 5' zpětný (reverse) primer 5' * AT ATCGT 3' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I TATAGCAACGGATCACCATAGCATTA 3' přímý (forward) primer 5' DNA templet dostupné na: https://toptipbio.com [vid 13.6.2023] Cross dimer Effect of Primer-Dimer Formation 5'-CGGAAACAAGGAGGATCTAT-3: I I I I I I I I 3'-TATG AAGGACCTT ACTTCCC-5' 15 kb Hairpin S'-GTCAGGATCv III ) 3'-CTATGTACGCCTTA*/ dostupné na: https://the-dna-universe.com/ [vid 13.6.20231 CO NAPIPETUJEME DO MIKROZKUMAVKY směs dTTP, dATP, dCTP, dGTP o H2N n ) i HO-P-O-P-O-P-O-i SN N a o- o- OH Deoxyadenosine triphosphate (dATP) HO-P-O-P-O-P-0 i i O' O' n>NH Deoxyguanosinejriphosphate (dGTP) HO-P-0 i o- 6- \gj OH Deoxythymidine triphosphate (dTTP) NH2 •N OOO i .....i IL Aj- HO-P-O-P-O-P-0—i NO Ó' O" ó- OH Deoxycytidine triphosphate (dCTP) Templátová DNA Nemusí být známa kompletní sekvence, ale aspoň úseky pro návrh primem JAK TO BĚŽÍ • Denaturace 95 °C (92 - 98 °C) OPTIMALIZACE! Created with BioRender.com 6 JAK TO BĚŽÍ S' ta 3 E o o CD "O CD oc O OG "O CD H—• CO CD o • Syntéza DNA 72 °C (70 - 74 °C) I I I Počet cyklů: 25 - 35, vždy negativní kontrolu!!! faktor zmnožení 2n- exponenciální průběh Cyklery my Cycle 1 yields 2 molpci lp« Cycle ? yields 4 molecLles Cycle 3 yields 8 molecules; 2 molecule* < (In white boxes) match target sequence Target sequence Genomic DNA 'jj> Oenaturation: Heil bne'ly to separate DNA Strands O Annealing: Cool to allow primers to form hydrogen bond with ends ol target sequence O Extension: ONA polymarAM adds nucleotides to the 3' end ol each primer 3 fc4s / \ 5' t d3 3 t I Primers^ j dostupné na: https://www.sciencedirect.com/topics/chemistrv/chain-reaction-step^ [vid 13.6.2023] JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Klasická PCR - odpověď ANO - NE dostupné na: https://en.wikipedia.org/wiki/Variable number tandem repeat [vid 9.6.2023] qPCR - současná amplifikace a detekce produktu v přítomnosti fluorescenční látky rychlejší (bez elektroforetické detekce produktu) spolehlivé výsledky citlivá detekce 1.000.900 S;implc j Platon "I TTutihoíí 1 CT / 1/ '■• Lxpvnrnti.il pluw Nu íeniulate PCR tycle nuitibei dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov [vid 9.6.2023] 1.0n 0.8H £ 0.6- i= m ■j S 0.4i ľ, í 0.2 D.D -1— 10 —i-r~ 20 30 PCR tyt lei -1— 40 —i 5-D dostupné na: http://www.bio-eauip.cn/ [vid 9.6.2023] 8 LZE KVANTIFIKOVAT NEJEN DNA, ALE I RNA AAA ftNfl KVALITA RNA!!! Reverse Transcription □ Piiint-r oligo(dT)12.2o random hexa - nonamery specifický primer(y) §AP,fiL cDNŮ PCR l sekvenčně-specifické primery Amplified DNA Amplification ■x i-1 —i i_ľ =r—i n-1 —i dostupné na: https://www.guora.com/What-does-reverse-transcriptase-PCR-do [vid 9.6.2023] KVALITA TEMPLÁTU (RNA) Analýza transkripce genů - izolace mRNA (smír 0.5 - 800 kb, většina 1.5-2 kb) Celková RNA - bandy 18S, 25S rRNA rostlinná RNA (A thaliana) © Miloslava Fojtova 10 KVALITA TEMPLÁTU (RNA) Bioanalyzér (Agilent) - elektroforetická separace na mikročipech Figure 1 A. total RNA sample waa degraded 1oi -. .hi-, im] times and ehe resulting samples wara analyzed nn ehe ŕqiloiH 2100 binanafyzar using die Eukiiŕo1o Tntal RNA Nano ast-ay. AshHtinwardk thnrler Fragmant tees o-an beobtBroed nidi proprBtting dagradalion. 90 830 c 70 S 60 S50 5 40 □= 30 20 10 D u 07-B Qfl-ŠM- ŕ 0.3 0.2 0.1 QO RIN 10 19 24 10 34 39 44 40 H B H d ľima C wcnrdi] 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 O.0 24 2 3 3 4 3 0 44 43 54 59 64 63 TimeLSůcondaj 24 2 3 34 3 3 44 49 54 &96163 Tmie onda ■ RIN 2 19 242934394149E4EŮ64 69 Time ísecondaj Figure £ Sample Blectropharngrams used (drain 1he RN4 I nlag rity Numbar lHINisatíwBra. Sample* i .in g o h oni intact ■ Hl Ň 10 ■. to dag radad i.fl IN 2i RIN (RNA Integrity Number) převzato z: RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control dostupné na: www.aqilent.com/chem/labonachip [vid 9.6.2023] PRIMERY PRO RT mRNA N BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTTT oligo(dT)18 plnodélková cDNA chyby - templáty s oligo(A) mRNA NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA NVTTTTTTTTTTTTTTTTTT ukotvené oligo(dT)18 plnodélková cDNA zabraňují nasedání na vnitřní části polyA (m)RNA N BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA genově specifické primery vysoká specifita vhodné pro one-step RT-PCR proporcionální přepis všech templátů -5=-5=-n b aa a a a a a aa a a aa a aa a a aa vVsoká koncentrace - pro krátké nnnnnn nnnnnn nnnnnn templáty se sekundárními strukturami náhodné hexamery Created with BioRender.com 12 NÁVRH PRIMERŮ PRO RT-PCR Primery ze sousedních exonů ex1 in1 ex2 ex1 ex2 genomová DNA RNA Created with BioRender.com 13 NÁVRH PRIMERŮ PRO RT-PCR Primery zasahují do sousedních exonů ex1 in1 ex2 in2 ex3 genomová DNA ex1 ex2 ex3 RNA X Ľ □ Created with BioRender.com 14 REVERZNÍ TRANSKRIPTÁZY enzym délka (kb) teplotní optimum citlivost "difficult templates" RNaseH modif. nucleotidy Transcriptor (Roche) 14 42-65 +++ +++ A A Expand (Roche) 14 42-50 ++ + N A AMV 12 42 (až 60) ++ + A A M-MuĽV 10 37 + +(+) A A C. therm. 3 60-70 ++ +++ N A Tth 1 55-70 + + N A 15 JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Annealing phase Extension phase (I) 4 Z$Í(S- Extension phase (II) End of PCR cycle ^W?—~=W^ ^—=^— —^fc—áiŕ^ifc—j^- jtŕ. 4--tW^ SYBR Green I fluorescence výrazně roste po vazbě na dsDNA absorbuje modré světlo (497 nm), emituje zelené světlo (520 nm), detekce na konci každého cyklu převzato z: der Velden et al., Leukemia 2003 doi: 10.1038/si.leu.2402922 relativně snadný návrh primem a optimalizace PCR pozor na nespecifické produkty (dimery primem)!!! - vždy na konci melting analýza - detekce fluorescence za vyšší teploty hand-made mixy s hot start polymerázou (náročné na přesnost pipetování - reproducibilita) komerční mixy - přidávají se pouze primery a templát reakce v multiplikátech (nejméně triplikáty), biologické repliky < z7 Cl S CD ČX> CD ro o ro cg TT CD Cl b č/5 < OD 3D O CD CD 7*0 — 16 JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Využití oligonukleotidových sond komplementárních k PCR produktu Vysoce specifická analýza Fluorophore Forward PGR primer O TaqMnn _^ Průbě Quencher Reverse PGR primer Polymerization Amplification Assay Fluorescence Probe displacement and cleavage PCR Producta Result fluorescence *°*--? Cleavage Products dostupné na: https://en.wikipedia.org/wiki/TaaMan [vid 9.6.2023] Hydrolytické próby • reportérovy fluorofor v blízkosti zhášeče • během amplifikace - hydrolýza próby - oddělení fluorochromu a zhášeče - detekce fluorescence • během PCR exponenciálně roste množství volných fluoroforů Ta q M a n próby: Firemní knihovny Validované sety (primery + próba) pro kvantifikaci transkripce v modelových organismech (člověk, myš, krysa, primáti, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis) 17 JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Využití oligonukleotidových sond komplementárních k PCR produktu Vysoce specifická analýza Hybridizační próby • dvě próby, jedna značená (3') donorovým fluorochromem (fluorescein), druhá (5') akceptorovým fluorochromem, homologní k vnitřní části amplifikovaného úseku • po hybridizaci - próby v těsné blízkosti • fluorescein je excitován modrým světllem -emise zeleného světla - emitované světlo excituje akceptorový fluorochrom - detekce • amplifikace - může hybridizovat více prób - vyšší signál detekované fluorescence • próby jsou během PCR stabilní dostupné na: https://www.sequencereferral.com/Technology.html [vid 9.6.2023] 18 JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Využití oligonukleotidových sond komplementárních k PCR produktu Vysoce specifická analýza Molekulární majáky • jednořetězcové oligonukleotidy • krátké koncové sekvence komplementární • jednořetězcový úsek komplementární k cílové sekvenci • po hybridizaci k DNA - delší a stabilnější hybrid než kmen sondy (v tom je např. jeden nekomplementární oligonukleotid) - emise fluorescence dostupné na: https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/technical-article/qenomics/qpcr/molecular-beacons [vid 9.6.2023] Loop Sequence 5' Reporter Amplified Target DNA 3' Quencher 1. Unbound beacon with 2. Bound beacon with quenched fluorescence unquenched fluorescence Sigma-Aldrich 19 JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ SYBR Green I analýza - specifita produktu PCR • pomalé zahřívání PCR produktu na 95 °C • prudký pokles fluorescence při teplotě kolem Tm Fluorescence 95 deg. JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Ct (CP) - cyklus, ve kterém fluorescence stoupne nad detekční limit přístroje závisí na počáteční koncentraci templátu: nižší koncentrace templátu - vyšší Ct vyšší koncentrace templátu - nižší Ct D 10 20 30 4D 50 PCR tyt lei dostupné na: https://www.bio-equip.cn/enshow1 equip.asp?equipid=1180 [vid 9.6.2023] JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Absolutní kvantifikace - koncentrace DNA je vyjádřena v absolutních čísle (počet kopií, jLtg/jLLl) KALIBRAČNÍ KŘIVKA - vzorky standardů o známé koncentraci Cycle lrf Concentration 10 10 1C 10 ' 10' 1C / Ttireshokj| / I / II / i \ Cycle Reaction efficiency (*) 1,00413 (* = 10A(-1/m)- 1) M -3,31208 B 22,34521 R Value 0,99991 RA2 Value 0,99981 © Miloslava Fojtová R - korelační koeficient (% dat v souladu se statistickou hypotézou) B - ..intercept", teoretické množství kopií detekovatelné v 1. cyklu M - sklon (směrnice) přímky, zásadní pro výpočet efektivity reakce optimálně -3.332 Reakční efektivita 1 - faktor amplifikace 2 JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Relativní kvantifikace - srovnání množství transkriptu mezi více vzorky vztažené k transkripci referenčního genu (konstantní množství ve všech analyzovaných vzorcích) Studovaný gen (GOI) Referenční gen (REF) cyklus PC R A Ct = Ct(GOI)B - Ct(GOI)A cyklus PCR ACt(A) = Ct(GOI)A-C A Ct(B) = Ct(GOI)B - C AA Ct = A Ct(B) - A Ct(A) R _ 2"AACt Created with BioRender.com JAK TO UDĚLAT KVANTITATIVNĚ Emulzní PCR - nejsou třeba žádné standardy ani reference! Poměr negativních reakcí vs. celkový počet reakcí. Lineární závislost mezi koncentrací cílové DNA a signálem. Princip: naředění a kompartmentalizace molekul templátové DNA a všech složek PCR do tisíců nanolitrových mikroreakcí (v emulzi voda - olej). Ideálně - každá kapka obsahuje max. jednu molekulu templátu. dostupné na: https://www.intechopen.com/ [vid 9.6.2023] K ČEMU TO JE • V medicíně diagnostika - prenatální testování - časná diagnostika nádorů - identifikace/kvantifikace hladin virů a bakterií (hepatitídy, herpetické viry, respirační viry, mykobakterie, bakteriální meningitidy, borelie, helicobacter,.....) Diagnostika SARS-CoV-2 - detekce virové RNA RT-PCR gen E (iontové kanály; infekčnost) gen S (trimery, vstup do hostitelské buňky) gen N (vazba k virové RNA, stabilizuje „beads on string" konformaci) gen M (abundantní, přes interakci s E proteinem - zakřivení membrány virového obalu) ^^r~~~~~~~^Ě k gen RdRP (potvrzující PCR) i NucIcocapsidfN) ^^^B (Protein & RNAgenome) SARS-CoV-2 dostupné na: https://www.invivogen.com [vid 13.6.2023] 25 K ČEMU TO JE • V medicíně diagnostika SARS-CoV-2 Příklady testů: • Kit na jednokrokovou PCR (RT + amplifikace) multiplexové uspořádání: jedna barva - virový gen primární screening (gen E) druhá barva - virový gen sekundární screening (RdRP) třetí barva - kontrola, housekeeping (referenční) gen (lidský gen - RP, ribonukleáza P, procesováni tRNA) KAM \ ROX CvS 400 450 500 550 600 650 700 750 800 Wavelength (nm) dostupné na: https://www.caister.com/hsp/supplementarv/pcr- troubleshootinq/c6f2.html [vid 13.6.2023] 26 K ČEMU TO JE V medicíně diagnostika SARS-CoV-2 Nonstructural proteins (nsp) Structural and accessory proteins r 9b 8b m_ 0RF1a 1 s I ORFIb 1—3 RdRPgene 5'»---- Primer F Probe-FAM Realtime RTPCR N2gene Amplification curve převzato z: Tombuloglu et al., Sci Rep. 2022 https://doi.Org/10.1038/S41598-022-06977-z 27 K CEMU TO JE • V medicine diagnostika SARS-CoV-2 2 * t » 10 12 U 18 II 21 22 24 26 20 B H 11 00 JB «) Cycle ■ N2' ■rORP' ■ RP' Amplification Plot ■2SJMO \ 2 * • ■ 10 12 14 1« M a 22 24 a 28 M J2 Ji M JB 40 *2 Cycle ■ n2* Hr / SONG [vid 13.6.2023] dostupne na: https://www.ebav.com.au/itm/133604446130 I [vid 13.6.2023] 33