MUNI SCI Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence v akci! Pokročilé metody pro vizualizaci a analýzu biomolekul Ctirad Hofr Pokročilé metody v současné genomice a proteomice MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr2 Přehled 1. Základy luminiscence – barevné a srozumitelné vysvětlení biofyzikálních základů absorpce, fluorescence, fosforescence, chemiluminiscence a elektrochemiluminiscence 2. Detekce proteinů a nukleových kyselin – využití fluorescence při analýze přítomnosti a vazby biomolekul 3. Pokročilé metody a aplikace – představení experimentálních přístupů a kombinací metod pro efektivní analýzu a tipů pro praktické použití MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr3 Otázky – praktické využití fluorescence • Jaké metody využívají detekce proteinů na základě vnitřní fluorescence aminokyselin? • Proč a jak se používá kombinace fluorescenčního přenosu energie a časově rozlišené fluorescence pro validaci přímé vazby biomolekul? • Které fluorescenční značky a sondy jsou vhodné pro kvantitativní analýzu přítomnosti proteinů a DNA a s jakou citlivostí? MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr4 Luminiscence kolem nás A glowing underground network of fungi - Attenborough's Life That Glows: BBC 2 https://youtu.be/33-3UCTRZWM?t=28 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr5 Luminiscence kolem nás – v lese https://youtu.be/33-3UCTRZWM?t=28 Armillaria bioluminescence https://www.youtube.com/watch?v=a2Bopi5AfAQ&t=77s MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr6 Přehled 1. Základy luminiscence – barevné a srozumitelné vysvětlení biofyzikálních základů absorpce, fluorescence, fosforescence, chemiluminiscence a elektrochemiluminiscence 2. Detekce proteinů a nukleových kyselin – využití fluorescence při analýze přítomnosti a vazby biomolekul 3. Pokročilé metody a aplikace – představení experimentálních přístupů a kombinací metod pro efektivní analýzu a tipů pro praktické použití MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr7 1. Barevné základy luminiscence barevné a srozumitelné vysvětlení biofyzikálních základů a) Absorpce b) Fluorescence c) Fosforescence d) Chemiluminiscence e) Elektrochemiluminiscence MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul l Světlo = Elektromagnetická vlna z xy c = l f c je konstanta – jestliže se zvýší vlnová délka, musí se snížit frekvence, aby byl součin konstantní. Vlnová délka l je nepřímo úměrná frekvenci f E = h f Čím je větší frekvence, tím je větší energie záření. Čím je vetší vlnová délka l, tím je menší energie záření. B E Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr8 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Luminiscence • Emise světla z nějaké látky; nastává z elektronových excitovaných stavů Luminiscence se dělí na: 1.fluorescenci 2.fosforescenci • Podle původu dělíme luminiscenci na • fotoluminiscenci 2. chemiluminiscenci MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence • Emise z excitovaných singletových stavů • Prakticky: fluorescenci pozorujeme během buzení a po jeho vypnutí rychle mizí • Doba dohasínání t (Lifetime) je průměrný čas, který uplyne od excitace po emisi – je řádově 1 – 10 nanosekund • pozn. : světlo urazí za 1 ns 30 cm MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fosforescence • Emise z excitovaných tripletových (zakázaných) stavů • Prakticky: fosforescence má mnohem delší dobu dohasínání než fluorescence Doba dohasínání řádově milisekundy až sekundy pozn. : světlo urazí za tu dobu 300 až 300 000 km MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Jak rozlišíme fluorescenci a fosforescenci? Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr12 C. Hofr MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Komentovaný úvod -fluorofor Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr13 Molecular Probes Tutorial Series—Introduction to Fluorescence www.youtube.com/watch?v=SGFlr1jFNBM MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Jak poznáme možný flouorofor? • molekula je planární • aromatická: obsahuje konjugované vazby Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr14 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Absorpce a emise energie molekulou Energieelektronu 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost elektronů od jádra Základní stav elektronu Excitovaný stav elektronu Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr15 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Shrnutí času a energie - zářivé a nezářivé přechody mezi elektronově vibračními stavy molekuly absorpce fluorescence fosforescence l t  10-15 s t  10-8 s t  10-3-100 s absorpce fluorescence fosforescence T1 S2 vnitřní konverze mezisystémová konverze S1 vibrační relaxace EnergieE=hf Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr16 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Vznik absorpčního~excitačního spektra Absorpční=excitační spektrum znázorňuje pravděpodobnost, že při dané vlnové délce dojde k excitaci fluoroforu dopadajícím světlem. https://youtu.be/SGFlr1jFNBM MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Vznik emisního spektra https://youtu.be/SGFlr1jFNBM Emisní spektrum,určuje pravděpodobnost, že dojde k emisi fluorescence o dané vlnové délce = barvě. Závisí na fluoroforu a je jeho charakteristikou. Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr18 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul SpektroFOTOmetr • Přístroj pro měření absorpce světla vzorkem Absorbance je měřena při různých vlnových délkách Výsledkem je absorpční spektrum látky zdroj štěrbina výběr vlnové délky vzorek detektor Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr19 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Geometrie při měření absorbance KyvetaDopadající světlo Procházející světlo Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr20 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul SpektroFLUOROmetr DetektorXenonová lampa Emisní monochromátor Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Geometrie při měření fluorescence Dopadající excitační světlo Emitované fluorescenční světlo KyvetaFluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr22 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr23 Chemiluminiscence • Chemiluminiscence je emise světla vznikajícího chemickou reakcí. • Molekuly s speciální strukturou mohou přejít do excitovaného stavu = získat excitované elektrony chemickou reakcí. Při přechodu z excitovaného stavu do základního je emitováno světlo. Vystavení značky alkalickému roztoku peroxidu vodíku vyvolá záblesk světla. Chemiluminiscence esteru akridinu po přidání peroxidu https://www.creative -diagnostics.com/ Chemiluminescence- Immunoassay-guide.htm MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr24 Bioluminescence • Bioluminiscence je druh chemiluminiscence, při které enzym katalyzuje přeměnu substrátu za vzniku excitované molekuly, která následně emituje světlo. • Křenová peroxidáza (HRP) katalyzuje rozklad luminolu v přítomnosti peroxidu za vzniku meziproduktu v excitovaném stavu. • Alkalická fosfatáza (AP) katalyzuje odštěpení fosfátové skupiny z AMPPD. se tato sloučenina destabilizuje a rozkládá se prostřednictvím excitovaného intermediárního aniontu AMPD, který následně vyzařuje světlo. Bioluminiscence Luminol-HRP (a) and AMPPD-AP (b). https://www.creative -diagnostics.com/ Chemiluminescence- Immunoassay-guide.htm MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr25 Elektrochemiluminiscence – princip • Pozoruhodná tím, že reagent je regenerován a používán opakovaně – recyklace. • Reagent - tris(bipyridyl) ruthenitý komplex Ru(bpy)3 3+ se za přítomnosti tripropylaminu (TPA) mění na – natý Ru(bpy)3 2+ excitovaný komplex, který přechází do základního stavu vyzařováním oranžového světla. • Ru(bpy)3 3+ lze zpětně regenerovat z Ru(bpy)3 2+ na elektrodě. https://is.muni.cz/th/269168/prif_b/ MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr26 Electrochemiluminiscence – aplikace https://youtu.be/GdLMyUnQn_o?t=25 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr27 Přehled 1. Základy luminiscence – barevné a srozumitelné vysvětlení biofyzikálních základů absorpce, fluorescence, fosforescence, chemiluminiscence a elektrochemiluminiscence 2. Detekce proteinů a nukleových kyselin – využití fluorescence při analýze přítomnosti a vazby biomolekul 3. Pokročilé metody a aplikace – představení experimentálních přístupů a kombinací metod pro efektivní analýzu a tipů pro praktické použití MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr28 Vnitřní fluorescence při detekci proteinů • Vnitřní fluorescence proteinů je nízká, daná hlavně Trp, Tyr • Zvýšená fluorescence po reakci s trihalogeny CHCl3 – přidává konjugovanou vazbu navíc. • Detekce proteinu na gelu bez nutnosti značení Ex 280 nm/ Em 360 nm Edwards, R.A., Jickling, G. and Turner, R.J. (2002) The Light-induced Reactions of Tryptophan with Halocompounds¶. Photochemistry and Photobiology, 75, 362-368. MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr29 Detekce proteinů bez následného barvení https://youtu.be/Dz6MCOSWw7k?si=lxSRZGriIfPBhXju&t=27 Princip sledování vazby biomolekul – anizotropie a polarizace Excitace v jednom směru nízká anizotropie usměrněnost vysoká anizotropie usměrněnost t ~ ns Emise fluorescence 30 Interakce biomolekul - CORE075 Ctirad Hofr MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Anisotropie fluorescence – uspořádání měření polarizátor analyzátor detektor • Hodnota anizotropie r je podíl rozdílu IVV - IVH intenzity fluorescence při rovnoběžném (vertikálním) a kolmém (horizontálním) natočení analyzátoru vůči excitačnímu polarizátoru a celkové intenzity fluorescence IVV+2IVH ve 3D tj. všech třech směrech šíření fluorescence. - Přístroj - fluorometr s polarizátorem excitačního světla a otočným polarizátorem = analyzátorem vyzářené fluorescence pro zjištění intenzity v různých směrech. - Potřebujeme ~ 10x vyšší koncentraci než na měření klasické fluorescence – polarizátory propouští 10x měně světla. - Hodnota anisotropie r je bezrozměrná veličina = podíl čísel. 𝑟 = 𝐼 𝛪𝛪−𝐼⊥ 𝐼 𝛪𝛪+2𝐼⊥ = 𝐼 𝑉𝑉−𝐼 𝑉𝐻 𝐼 𝑉𝑉+2𝐼 𝑉𝐻 31 Interakce biomolekul - CORE075 Ctirad Hofr P = 𝐼 𝛪𝛪−𝐼⊥ 𝐼 𝛪𝛪+𝐼⊥ = 𝐼 𝑉𝑉−𝐼 𝑉𝐻 𝐼 𝑉𝑉+𝐼 𝑉𝐻 Vazebná afinita z anizotropie fluorescence 0 25 50 75 100 0 20 40 60 80 100 %vazby Koncentrace přidávaného proteinuSložení roztoku v měřící kyvetě Anisotropie fluorescence – princip • „Usměrněnost“ emitovaného světla se zvýší po vytvoření komplexu protein-DNA; po excitaci lineárně polarizovaným zářením dochází k emisi fluorescence značené molekuly převážně v jednom směru. Prakticky • značíme menší z molekul. • přidávaný protein není značený. • koncentrace přidávaného proteinu je minimálně 10x větší než koncentrace značeného proteinu Disociační konstanta KD - koncentrace proteinu, při které je obsazena polovina vazebných míst na DNA. KD 32 Interakce biomolekul - CORE075 Ctirad Hofr MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Interakce biomolekul - CORE075 Ctirad Hofr33 Praktická poznámka Pro detekci interakce dvou různě velkých molekul je vhodnější fluorescenčně naznačit malou nebo velkou molekulu? A) Velkou molekulu, protože bude lépe vidět. B) Malou molekulu, protože je pohyblivější a vazba s velkou molekulou více ovlivní její vlastnosti. C) Je to jedno. MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr34 Přehled 1. Základy luminiscence – barevné a srozumitelné vysvětlení biofyzikálních základů absorpce, fluorescence, fosforescence, chemiluminiscence a elektrochemiluminiscence 2. Detekce proteinů a nukleových kyselin – využití fluorescence při analýze přítomnosti a vazby biomolekul 3. Pokročilé metody a aplikace představení experimentálních přístupů a kombinací metod pro efektivní analýzu a tipů pro praktické použití MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr35 FRET – rezonanční přenos energie • Rezonanční přenos energie je nezářivý přenos energie mezi dvěma molekulami fluorofory. Je známý také jako Försterův či fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET). Při FRET může donorový fluorofor přenášet energii na akceptorový chromofor prostřednictvím nezářivé dipólově-dipólové interakce. • Účinnost přenosu energie je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem, takže FRET je velmi citlivý na malé změny vzdálenosti biomolekul. MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul K čemu lze použít rezonanční přenos energie? • Konformační změny • Vazba ligandu a receptoru • Štěpení proteinu/DNA • Fúze membrán Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr36 http://www.olympusfluoview.com/applications/fretintro.html MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Interakce dipólových momentů přechodu Donoru a Akceptoru Donor Akceptor Absorpce donoru Emise donoru Absorpce akceptoru Emise akceptoru Abs l(nm) Fluorescence Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr37 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul FRET - nezářivý přenos energie • V přítomnosti vhodného akceptoru může donor přenést energii excitovaného stavu přímo na akceptor bez vyzáření fotonu. • Takto excitovaný akceptor pak vyzáří energii, kterou původně absorboval donor. Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr38 http://www.olympusfluoview.com/applications/fretintro.html MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul FRET umožňuje rozlišit mezi více variantami uspořádání flexibilních proteinů • apoA-I protein reguluje metabolismus cholesterolu. • apo A-I se váže do lipidové membrány • byla navržena dvě možná uspořádání proteinů v membráně • kvůli flexibilitě lipidů není možno použít strukturní metody • jeden z řetězců apoA-I proteinů byl naznačen fluoresceinem (Donor) a druhý tetrametylrodaminem (Akceptor) • Nejdříve bylo změřeno emisní spektrum samotného donoru na jednom řetězci ApoA-I • Po přidání druhého řetězce s akceptorem byl sledován úbytek intenzity fluorescence donoru • Detekce výrazného rezonančního přenosu energie proakuzuje relativně malou vzdálenost mezi donorem a akceptorem • Bylo potvrzeno pásové uspořádáni ApoA-I http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la402727a Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr39 Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006 Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul 8 40 FRET mezi CFP a YFP detekce v buňkách CFP YFP https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Zhášení FRET fotovybělováním akceptoru CFP YFP https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul 8 42Dreamstime MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul 8 43 Skládání proteinů in vivo • ApoE4 je spojen s Alzheimerovou nemocí a váže se na nervové buňky • ApoE3 má podobnou sekvenci aminokyselin, ale na nervové buňky se neváže • Bylo navrženo, že vazebná schopnost k nervovým buňkám souvisí s různým uspořádáním domén ApoE proteinů • Pro ověření byly v nervových buňkách transfekovány ApoE konstrukty • FRET analýza ukázala, že ApoE4 v konformaci se spojenými doménami se váže na nervové buňky, zatímco ApoE3 nemá své domény ve vzájemné blízkosti a na nervové buňky se neváže Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Nejkrásnější aplikace FRET FRET byl použit pro vizualizaci fúze lipidových dvojvrstev s vezikuly: Meziprodukty zachycené pomocí vysokorychlostní mikrofluorescenční spektroskopie Lei, G and MacDonald, R.C., Biophys J. 2003 Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr45 FLIM – doba dohasínání fluorescence • Doba dohasínání fluorescence (lifetime) je průměrná doba, za kterou se excitovaná molekula po absorpci vrátí do základního stavu. • Pokud je populace fluoroforů excitována, doba života je doba, za kterou se 36,8 % původní populace excitovaných molekul vrátí do základního stavu. • Doba života fluorescence je důležitým parametrem pro praktické měření fluorescenčního rezonančního přenosu energie. MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 500 1000 time, ps I(t) Jak dlouho trvá fluorescence? Populace molekul excitovaných zábleskem (pulsem) Náhodné dohasínání zpět do základního stavu: každá molekula emituje 1 foton t=1/e=37% Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr46 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence LifeTime Imaging Microcsopy FLIM • Sledování časové závislosti fluorescence v 2D prostoru. • Umožňuje rozlišit prostředí ve kterém se fluorofory nacházejí. • Umožňuje sledovat zhášení flouroforů, ať už vlivem prostředí, zhášedla nebo interakce s jinými molekulami. Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr47 Olympus inc. MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Použití FLIM při sledování interakce proteinů H. Wallrabe and A. Periasamy, Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy, Current Opinion in Biotechnology, Volume 16, Issue 1, Analytical biotechnology, 2005, Pages 19-27. Rychlejší dohasínání v přítomnosti zhášejícího proteinu Normální - pomalé dohasínání FRET-FLIM mikroskopie byla využívána při charakterizaci vytváření dimeru transkripčního faktoru C/EBPα uvnitř jádra živých buněk GHFT1-5. Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr48 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr49 Kombinace FRET-FLIM pro spolehlivou detekci vazby a hledání nových léčiv • In vitro detekce interakce proteinů na destičce. • High-throughput testování interakce proteinů a nalézání malých molekul, které narušují vazbu proteinů – možná budoucí léčiva. https://youtu.be/Kj901Lz_KGM?si=sCph7v2evHEHme6f&t=56 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr50 PLA – proximitní ligační analýza PLA Protein Detection Technology https://youtu.be/pF4Jw4tEf-M?si=A3-pzSP2hOl9YkJO&t=9 MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr51 Nanočástice zlata mají unikátní vlastnosti • Při rozměru nanočástic zlata kolem 40 nm ovlivňují apsorbci světla • Agregací nanočástic zlata dochází ke změně barvy – citlivá detekce interakce. • Nanočástice ovlivňují dopadající světlo, protože zlato je kov, jehož elektrony se mohou volně pohybovat. Při správné vlnové délce světla lze tyto elektrony přimět k tomu, aby oscilovaly na stejné frekvenci. Tato vlastnost zlata se nazývá povrchová plasmonová rezonance a lze ji využít k přeměně nanočástic zlata na velmi přesné detektory navázaných molekul. MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr52 Využití nanočástic zlata při detekci nového života https://youtu.be/Tv9B4m7o364?si=VeuD0d_VQYAXAX5T MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr53 Případová studie Jakou metodou lze zjistit, zda se molekuly nacházejí v blízkosti náhodně, nebo se skutečně vážou? A. FRET-FLIM B. PLA C. Modifikované zlaté nanočástice MUNI SCI NCBR Národní centrum pro výzkum biomolekul Fluorescence – PokroGENPRO Ctirad Hofr54 Otázky – praktické využití fluorescence 1. Jaké metody využívají detekce proteinů na základě vnitřní fluorescence aminokyselin? 2. Proč a jak se používá kombinace fluorescenčního přenosu energie a časově rozlišené fluorescence pro validaci přímé vazby biomolekul? 3. Které fluorescenční značky a sondy jsou vhodné pro kvantitativní analýzu přítomnosti proteinů a DNA a s jakou citlivostí?