Pokročilé metody v genomice a proteomice:
analýza proteinových komplexů
NPO_MUNI_MSMT-16606/2022
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
laboratoř Strukturních proteinů eukaryotních chromosomů
(http://www.ncbr.muni.cz/SPEC/)
datum čas přednášející přednáška
20.9.2024 12-14 dr. Petra Schrumpfová-Procházková Metody extrakce, purifikace a kvantifikace nukleových kyselin
14-16 doc. Miloslava Fojtová qPCR – princip, moderní přístupy, aplikace, především v klinice
27.9.2024 12-14 doc. Jan Hejátko Analýza genové exprese a nástroje systémové biologie
14-16 prof. Jiří Fajkus Metody sekvenování DNA a RNA
4.10.2024 12-14 dr. Petr Fajkus Příprava knihoven pro sekvenování nové (NGS) a třetí generace (TGS)
14-16 dr. Vratislav Peška Analýza sekvenčních dat
11.10.2024 12-14 doc. Miloslava Fojtová Epigenetika – o co jde, jak to funguje a co se stane, když to nefunguje
14-16 prof. Jiří Fajkus Analýza epigenetických značek a struktury chromatinu
18.10.2024 12-14 doc. Ctirad Hofr Pokročilé fluorescenční metody při detekci, analýze a vizualizaci biomolekul
14-16 prof. Zbyněk Zdráhal Nové trendy v proteomice pomocí hmotnostní spektrometrie
25.10.2024 12-14 doc. Jan Paleček Pokročilé metody analýzy proteinových komplexů
O čem už jste slyšeli …
GENOMIKA
PROTOMIKA
• Co všechno se dozvíte o genu/proteinu z databází
• 3D (terciární) struktura proteinů
• Proteinové interakce
• Proteinové komplexy (kvarterní struktura)
• Jak získat nové informace o proteinových komplexech experimentálně
• Analýza komplexů
• Vizualizace komplexů …
… a o čem uslyšíte
Histon H3
NGS přináší nevídané množství dat
• rychlé sekvenování genomů poskytuje informace o proteinech v různých
organismech
• proteinové databáze UNIPROT (SWISSPROT…): https://www.uniprot.org/
• potvrzuje představu evoluce proteinů/organismů – ukazuje na velkou
konzervovanost většiny proteinů
• tyto podobnosti umožňují modelování proteinů
i z málo charakterizovaných organismů
(a jejich anotaci):
spolehlivé modelování pro homologie >30%
(Rosetta, AlphaFold …)
Základníalignment
• pokud pracujete s novou sekvencí (např. není v UNIPROT): BLAST – https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
• hledání příbuzných sekvencí vám napoví nakolik je protein evolučně konzervovaný, jaké má domény
… jakou mají funkci jemu podobné proteiny (např. UNIPROT databáze)
printscreen: autor
UniProtajehomožnosti
Hledání
proteinu
Souvislosti
Funkce
Interaktom
Mutace
Vizualizace
Alphafold
Lokalizace proteinu
Stahování
dat
Komplexní, vysoce kvalitní a volně přístupný zdroj sekvenčních a funkčních
informací o proteinech
• Popis a funkce
• Zjištění přítomnosti domén daného proteinu
• Zjištění interakčních partnerů
• Struktura proteinu – PDB, Alphafold … komplexy
UniProt–vyhledávání Histon H3
https://www.uniprot.org/
… i lidský
printscreen: autor
Histon H3
upozornění: informace nebývají kompletní (i chybné) – dohledat v článcích
Informaceoproteinu-UNIPROT
Genová ontologie
Saccharomyces cerevisiae
jádro – genom
chromatin
chromatinnucleosome
printscreen: autor
Histon H3
Informaceoproteinu-UNIPROT
H3K9ac
H3K56ac
histone code
printscreen: autor
Histon H3
Informaceoproteinu-UNIPROT
printscreen: autor
Histone fold
Proteinovédomény
https://prosite.expasy.org/, https://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam
printscreen: autor
Proteinovédomény
NF-Y
podobné domény
printscreen: autor
Informaceoproteinu-UNIPROT
Histon H3
terciární a kvarterní struktura
sekundární struktury
Histone fold
video a printscreen: autor
Primárním zdrojem strukturních informací = PDB
Interaktivní web PDB-101 (pro učitele): https://pdb101.rcsb.org/
voda, ATP ATP pumpa
mikrotubuly chromatinaktin-myosin
přes 200 000 strukturprintscreen: autor
AlphaFold2
převzato z: Jumper et al., Nature, 2021; neural network: transformer architecture (attention mechanism for learning)
Nobelova cena
za chemii 2024
J.M. Jumper
EMBL databáze: https://alphafold.ebi.ac.uk/ 200 000 000 struktur!
Histon H3
Informaceoproteinu-UNIPROT
nucleosome
nucleosome
video a printscreen: autor
Informaceoproteinu-UNIPROT
H3
H3
H4
H4
kvarterní struktura
Histon fold –
typicky P-P vazba
… vazba na DNA
H3-H4 dimer
video a printscreen: autor
Informaceoproteinu-IntAct
https://www.ebi.ac.uk/intact
Histon H3
H3
H3
H4
H4
chaperon
deacetylasa
metyltransferasa
chaperon
metyltransferasa
bromodoména
chaperon
histon H4
network
síť
… i genetické (nefyzické), funkční … interakce
H3H4
video a printscreen: autor
Histon H3
https://www.ebi.ac.uk/complexportal/complex
H3
H4
H3
H4
H2A
H2B
video a printscreen: autor
komplex - struktury
AlphaFold3–predikce3Dstrukturykomplexů
• Online predikce Alphafold: https://golgi.sandbox.google.com/
• Umožňuje i predikci 3D struktury proteinového komplexu (dimeru dvou proteinů – díky jejich koevoluci)
printscreen: autor
Informaceoproteinu-UNIPROT
Histon H3
H3-H3 dimer vygeneroval alphafold jako
H3-H4 dimer – až po použití H3-H4+H3
umístil H3-H3 dimer správně
video: autor
terciární a kvarterní struktura
- H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer
nukleosom se skládá na „začátku“
(replikace DNA – vznik nové DNA …), ale i v
průběhu života buňky (oprava DNA,
transkripce) – odbalení a sbalení
nukleosomu regulují chaperony,
remodelační komplexy …
video: autor
video: autor
- H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer – vazba na DNAvideo: autor převzato z: Mol. biol buňky
- H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer
- dimery H2A-H2B (H2B – váže H4)video: autor převzato z: Mol. biol buňky
3AFA- H3-H3 interakce = (H3-H4)2 tetramer
- dimery H2A-H2B (H2B – váže H4)video: autor převzato z: Mol. biol buňky
- modifikace (např. acetylace) mohou: vázat jiné proteiny (změní tvar povrchu –
váže specificky bromodoména) nebo oslabit interakce (změní náboj povrchu –
oslabí vazbu s DNA a rozvolní nukleosom) – pozice PTM1KX5
H3K56ac
Modifikace histonů – H3K56ac
H3K9ac
video: autor
bromodoména váže
acetylovaný histon
H3
BDF1
Modifikace histonů – H3K9ac
- modifikace (např. acetylace) mohou: vázat jiné proteiny (změní tvar povrchu –
váže specificky bromodoména) nebo oslabit interakce (změní náboj povrchu –
oslabí vazbu s DNA a rozvolní nukleosom) – pozice PTM
video a printscreen: autor
https://www.doc.gold.ac.uk/bioblox/
Docking - hra
https://www.youtube.com/watch?v=u_-8JyCWpEQ&t=7s
printscreen: autor
Huddy et al., Nature, 2024
Predikce proteinů a komplexů - nanostruktury
Nobelova cena
za chemii 2024
D. Baker
Huddy et al., Nature, 2024
Predikce proteinů a komplexů - nanoklece
Nobelova cena
za chemii 2024
D. Baker
Pokročilé metody v analýze proteinových komplexů
• Co všechno se dozvíte o genu/proteinu z databází
• 3D (terciární) struktura proteinů
• Proteinové interakce
• Proteinové komplexy (kvarterní struktura)
• Jak získat nové informace o proteinových komplexech experimentálně
1. - identifikace genů/proteinů … jejich partnerů (PPI) … izolace komplexu
- funkce podjednotek (genetická analýza, lokalizace v buňce …)
2. - charakterizace komplexu
- vzájemné PPI podjednotek – architektura komplexu
3. - rekonstituce, struktura a analýza aktivit celého komplexu in vitro
- struktura: crosslink MS, X-ray, (cryo) elektronová mikroskopie, modelování, integrativní
analýza
4. - vizualizace komplexů …
Ko-purifikace - ověření
silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat a následně ko-purifikovat
Totalextract
FT
Solublefraction
25
35
40
55
70
1.
Input
15
10
25
35
40
55
70
15
10
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
FT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Elution fractions – 10ml Elution fractions – 1,5ml
Nse3
Nse1
Nse4
1. His-tag Nse3
(Nse3 více než Nse4)
2. Strep-tag Nse4
(srovnal se poměr Nse3:Nse4)
Strep
Strep
6xHis
Nse4Nse3Nse1
Značky na různých podjednotkách komplexu –
postupná purifikace => kompletní komplex
(přirozený poměr podjednotek v komplexu)
převzato ze: Zabrady et al, NAR, 2016
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
AU
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0% Buffer B
60.00 120.00
Rack Pos.:
Tube #:2
A
4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1
B
3 5 7 9 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41
15
25
35
40
55
70
input
29A
30A
31A
32A
33A
34A
35A
36A
37A
38A
39A
40A
41A
42A
1B
2B
3B
4B
5B
6B
7B
8B
9B
10B
11B
12B
Nse1-3-4 Nse1-3 Nse1
Nse1,-3,-4
Nse1,-3
Nse1
3. Gelová filtrace – lze ještě dočistit subpopulace komplexů
Nse3
Nse1
Nse4
agregáty
Ko-purifikace - příprava
- analýza aktivit in vitro
- analýza struktury …
převzato z: Roux, CMLS, 2013; Sinz, MS Reviews, 2006
Identifikace
podjednotek
komplexu
Mapování
interakcí
podjednotek
Detailní mapování komplexů - crosslinking
crosslink propojí podjednotky - stabilizuje komplex
- estery reagují s Lys (ε-amin)
- homofunkční - spojí proteiny
dohromady v jednom kroku
- heterofunkčních - postupná aktivace
převzato z: Adamus et al, JMB, 2020
- krosslink pomůže upřesnit strukturní model (Nse1-Nse3)
- ukázal jak jsou ramena Smc5-Smc6 vedle sebe umístěna
remodelační komplex
krosslink podjednotek a mapování na připravené
modely
převzato z: Mashtalir et al, Cell, 2020
Integrativní modelování
převzato z: Mashtalir et al, Cell, 2020
remodelační komplex
sběr velkého počtu
částic, klasifikace a
rekonstrukce struktury
komplexu
převzato z: Mashtalir et al, Cell, 2020
remodelační komplex
sběr velkého počtu
částic, klasifikace a
rekonstrukce struktury
komplexu (crosslinky,
krystaly – integrativní
modelování)
převzato z: Mashtalir et al, Cell, 2020
remodelační komplex
zachyceno několik
konformací + rozdíly v
krosslinku = dynamika
remodelační
komplex
pomáhá v
transaktivaci
genové exprese –
váže acetylované
H3 (bromodomény)
- uvolňuje
nukleosom (volnější
konce DNA)
převzato z: Mashtalir et al, Cell, 2020
převzato z: Marsh et al, ARB, 2015
- krystalografie – nejvhodnější
(boom v 1. dekádě díky
sekvenačním projektům)
- NMR je limitována velikostí
- cryoEM je vhodná pro velké
komplexy (boom v současnosti)
Strukturní metody
převzato z: Speranzini et al, EMBO J, 2016
Analýza proteinových komplexů
viz doc. Hofr
viz prof. Zdráhal
převzato z: Birnie et al, ACS nano, 2020
… speciální biofyzikální
metody …
AFM
Optické pinzety
převzato z:
Ando et al, Annu Rev BioPhys, 2013
AFM
(atomic force microscopy)
převzato z: Ganji et al, Science, 2018; Takahashi, CO in CB, 2019
konce molekuly DNA uchyceny
přidán SMC komplex + vazba a
hydrolýza ATP – vytvoření
smyčky („loop extrusion)“
převzato z: Ozer et al, CO in SB, 2015
úrovněproteinovýchkomplexů
převzato z: Johnson et al., Nat Meth, 2015
Existuje mnoho
nástrojů na
visualizaci
komplexů (i v
buněčném
prostředí)
od PyMOL pro
přímou visualizaci
krystalových
struktur
… až po CellPACK
pro interaktivní
náhled do buňky a
jejích procesů
…vychází z herních
a animačních
algoritmu …
Visualizace proteinových komplexů
Visualizace proteinových komplexů
Existuje mnoho
nástrojů na
visualizaci
komplexů
od PyMOL pro
přímou visualizaci
krystalových
struktur … 3D tisk
Johnson et al., Nat Meth, 2015; Iwasa, CO in SB, 2015
Visualizace proteinových komplexů
Pro lepší představu (virové částice) se integrují … (nakopírované) struktury,
data z molekulární dynamiky (simulací), koordináty pohybu „objektu“ ve
světelném mikroskopu … animovat i buněčný kontext – namíchat v „reálných“
poměrech do „organel“ a na „membrány“ – CellPack …
Lze použít k testování modelů …
Malý průlet světem buňky
dostupné: https://www.youtube.com/watch?v=FJ4N0iSeR8U
většina … proteinové komplexy …
… chromosomy
Jaké proteinové komplexy poznáte?