Imunitní systém ve zdraví a nemoci Hrazeno z projektu MUNI 3.2.1, realizovaném v rámci Národního programu obnovy pro oblast vysokých škol pro roky 2022-2024, reg. číslo NPO_MUNI_MSMT-16606/2022. Imunitní systém ve zdraví a nemoci2 Imunologické metody doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D. Obsah Serologické – precipitační, imunodifuze, aglutinace, hemaglutinace, HIT, KFR, imunoelektroforéza, imunofixace Metody vyšetření KS, fagocytózy, separace buněk, počítání leukocytů, krevní diferenciál Metody stanovení protilátek Imunoprecipitační křivka (Ag – antigen, Ab – protilátka) Oblast nadbytku protilátky Vzrůstá mn. precipitátu s s přídavkem Ag, nestabilní IK Nekompetitivní metody • zákalové nefelometrie turbidimetrie • s markerem EIA Oblast ekvivalence Mn. precipitátu nejvyšší, nejvyšší stabilita IK Precipitační metody, okometricky Oblast nadbytku antigenu Tvoří se malé komplexy IK, které neprecipitují, nestabilní Kompetitivní metody • heterogenní RIA, ELISA… Serologické metody - precipitace ̶ Ag + Ab → Ag-Ab ̶ precipitinogen precipitin precipitát sraženina ̶ solubilní /rozpustný/ praxe – 1. zjištění a stanovení výskytu Ab v séru při inf. onemocnění 2. identifikace patogena Koncentrace Ab se vyjadřuje jako TITR SÉRA. = nejmenší zředění Ab, které ještě reaguje s Ag - hodnocení : kvalitativně – odečtení okem, pokud dostatečné mn. precipitátu (více než 0,1g/l), při nižším mn. - fyzikálně • kvantitativně : a, zjištěním množství precipitátu b, zjištěním množství Ag v precipitátu či supernatantu c, fyzikálně - změna optických vlastností vzorku – 2 fyzik.metody : NEFELOMETRIE – TURBIDIMETRIE Nově - Ab, Ag značené - RIA,FIA,EIA PRECIPITAČNÍ metody: •využití : ke stanovení Ag, Ab, H př. Precipitační imunochemické metody Screeningové metody – jednoduché precipitační chromatografické testy - terénní kazetové testy pracující na bázi chromatografie a v oblasti ekvivalence S T C S T C Negativní výsledek (Ag v testu, ne v moči) Pozitivní výsledek (Ag v testu i v moči) Za nepřítomnosti nebo nedostatku drogy ve vzorku moče vytvoří protilátka imunokomplex (precipitát) se značenou drogou vázanou v místě testu T. (S – vzorek, C – kontrola) Imunodifúze - specifická reakce Ag s Ab - precipitace /gel z agaru nebo agarózy/- AGAR  směs polysacharidů extrahovaných z červených mořských řas  → přírodní agar nutno přečišťovat  frakcionací vznikají 2 složky:• agaróza - neobsahuje vedlejší aniontové skupiny - pro difúzi více vhodná - standardnější složení než agar a nižší schopnost nespecifické adsorpce • agaropektin -obsahuje aniontové skupiny → pro difúzi nevhodný -používá se v konc. 0,5-2% ̶ příprava gelu: ̶ rozvaření agarózy v pufru na vodní lázni ̶ nanesení na skleněné destičky – ztuhnutí ve vodorovné poloze /při teplotě pod 42°C/ ̶ princip ID: ̶ vzájemná volná difúze Ab a Ag v gelu na základě koncentračního spádu až do místa střetnutí  zde vznikají precipitační linie→obloučky→prstence→kruhy /záleží na použitém materiálu/ ̶ vzniklé precipitáty detekujeme:  okem - zákal  barvením – Coomassie blue, amidočerň  sekundárními protilátkami  Au, Ag, radioizotopy (FIA) - vznik precipitátů je děj postupný!!! jednoduchá jednorozměrná imunodifúze  dle OUDINA - ve spodní části zkumavky agarózový gel s Ab, převrstveno roztokem s Ag - zalito parafínovým olejem – zábrana odpařování - čím je Ag koncentrovanější, tím dále od roztoku s Ag vznikají precipitační linie /odečitatelnější/ - využití: • detekce počtu Ag párů Imunodifúze jednoduchá radiální /dvojrozměrná/ imunodifúze dle MANCINIOVÉ - na skleněnou destičku se nalije gel, který obsahuje Ab → nemigruje inkubace ve vlhké komůrce ve vodorovné poloze → difúze všemi směry (radiální) po obarvení - modré precipitační prstence → čím je vzorek koncentrovanější – větší průměr prstence → změření druhé mocniny průměrů prstenců – vynesení kalibrační křivky a odečet koncentrace neznámého vzorku- využití: • ke kvantitativnímu stanovení Ag • klinická praxe: dříve stanovení koncentrace IgG, IgA, IgM, IgD, podtříd IgG, složek komplementu a proteinů akutní fáze, nyní jen IgD, protože má nízkou aviditu (pro nefelometrii se nehodí) jamky - vzorky: -gel s Ab  fyziologický roztok –blank  vzorky o neznámé koncentraci  vzorky o známé koncentraci (kalibrační) Aglutinační metody ̶ Ag + Ab → Ag-Ab ̶ aglutinogen aglutinin aglutinát - princip : KORPUSKULÁRNÍ / částicový / Ag ̶ při reakci dochází ke shlukování Ag a Ab na základě vytváření můstků - Ab mezi buňkami za vzniku shluků ̶ přímá – použití bakterií, buněk ̶ nepřímá, pasivní – na jejich povrch je Ag uměle navázán př.latex-fixační test, HIT ̶ Nejúčinnější AgM-multivalence, IgG nejčastější ̶ Předpoklady ke vzniku vazeb: 1. dostatek Ab 2. přítomnost Ab proti různým epitopům 3. vzdálenost mezi částicemi co největší 4. Ab funkčně jednovazebné nevytváří aglutinaci (IgA, IgE) 2. – inkompletní Ab viz hemaglutinace Latexová aglutinace, latex-fixační test ̶ rychlé kvalitativní stanovení ̶ Ag nebo Ab imobilizován na latexových kuličkách ̶ Stanovení Ab proti IgG – revmatoidní faktor ̶ Průkaz patogenních Antigenů (Helicobacter pylori, Adeno- a Rotavirus) Rozdíl mezi aglutinací a precipitací Aglutinace • využití : ke stanovení Ag, Ab, H (viz precipitační metody) 1. K určování izolovaných bakteriálních kmenů 2. K průkazu Ab proti patogenům –Widalova reakce – průkaz tyfu, paratyfu, Weil-Felixova – skvrnitého tyfu, Ab proti Francisella tularensis 3. K Průkazu Treponema p., EBV – mononukleóza 4. Nepřímá - k průkazu auto Ab proti štítné žláze, Ab proti autoAg – 1. - hodnocení: kvalitativně - odečtení okem ̶ kvantitativně : a, zjištěním množství aglutinátu ̶ b, zjištěním množství Ag v aglutinátu ̶ Nevýhoda: nízká citlivost okolo 0,2-2mg Ab ̶ Titr séra: nejvyšší zředění, které ještě vyvolá vznik aglutinátu Ke zviditelnění aglutinačních reakcí při použití inkompletních Ab je možno použít a) aglutinaci v bílkovinném prostředí b) v prostředí s proteolytickými enzymy c) použitím antiglobulinového Coombsova séra - králičí ab proti lidským Ig ̶ využití : ke stanovení Ag, Ab, H (viz precipitační metody) 1.K určování izolovaných bakteriálních kmenů 2.K průkazu Ab proti patogenům –Widalova reakce – průkaz tyfu, paratyfu, brucelám, listeriím Weil-Felixova – skvrnitého tyfu, Ab proti Francisella tularensis 3.Nepřímá k průkazu auto Ab proti štítné žláze, Ab proti jiným autoAg , RF Latexová aglutinace, latex-fixační test ̶ rychlé kvalitativní stanovení ̶ Ag nebo Ab imobilizován na latexových kuličkách ̶ Stanovení Ab proti IgG – revmatoidní faktor Hemaglutinace - využití: K zjišťování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům, průkaz lues, Přímý Coombsův test – k průkazu navázaných antierytrocytárních Ab, reakce pacientových ery s Coombsovým antisérem, přítomnost navázaných Ab se projeví hemaglutinátem - Nepřímý Coombsův test – k průkazu cirkulujících antierytrocytárních Ab - 1. fáze, pacinetovo sérum s ery od dárce, navázání Ab pokud jsou přítomny, vymytí, přidání Coomsova séra, které způsobí aglutinaci ̶ při 2 reakcích: ̶  HIT – hemaglutinačně inhibiční test ̶  KFR – komlement fixační reakce ̶ Ag + Ab → Ag-Ab ̶ hemaglutinogen hemaglutin hemaglutinát ̶ - savčí krvinky (i části) ̶ - dochází ke shlukování krvinek, vlivem komplementu či virové částice pak dochází k LYZI. Nevýhoda: ery mohou lyzovat (nízká životnost) nebo se při skladování shlukovat HIT ̶ Patří také mezi metody serologické, založené na inhibici biologických účinků antigenů ̶ HIT – pasivní hemaglutinace ̶ Vycházíme ze skutečnosti, že viry (některé bakterie atd) mají schopnost se spontánně absorbovat na červené krvinky (rozpustný Ag). Ery pak aglutinují – shlukují se jen v přítomnosti specifické Ab (Ab + Ag - Ery aglutinace č.krvinek) , tj stav, kdy odpovídá protilátka Ag a tedy se po přidání obalených ERY Antigenem se Ag vyváže protilátkou a vznikne HEMAGLUTINÁT Ab + Ag - Ery → hemaglutinát, proběhne hemaglutinace • neodpovídá-li protilátka virovému Ag, nedojde k hemaglutinaci v situaci, kdy přidáme stejný Ag do reakce ̶ Ab + Ag - Ery → hemaglutinát + stejný Ag → Ag + Ab, Ag - Ery → inhibice hemaglutinace ̶ Metodou inhibice pasivní hemaglutinace lze dokázat velmi malé mn. rozpustného Ag nebo H (metoda je velmi citlivá) pro vyhodnocení můžeme použít i optické metody Komplementové metody metody využívající faktu aktivace komplementového systému komplexem – antigen-protilátka, Komplement fixační reakce Složky reakce: Ab, Ag, C, ERY, hemolyzin • Ab- vyšetřované sérum - chceme v něm prokázat protilátku / komplement v séru je tepelně inaktivován / • známý specifický Ag - jsou-li v séru Ab, vytvoří se imunokomplex IK • KOMPLEMENT - zdrojem nejčastěji sérum morčete (váže se na IK a aktivuje protilátku) hemolytický komplex: komplex Ag /beraní ERY/ a protilátky  EMBOCEPTORu /hemolyzinu/, získaného imunizací králičího séra beraními erytrocyty →aby došlo k hemolýze je nutná spoluúčast KOMPLEMENTU a inkubace 30 minut při 30 C KFR průběh reakce:  POZITIVNÍ  ve vyšetřovaném séru je Ab protilátka v séru vytvoří komplex s Ag – na něj se naváže komplement. Po přidání hemolytického systému nezbývá již komplement do 2. části reakce → k hemolýze NEDOJDE:  NEGATIVNÍ  ve vyšetřovaném séru není Ab - v 1. fázi reakce se nevytvoří IK – komplement se nevyváže a zbývá do 2. fáze reakce, kdy aktivuje hemolyzin → DOJDE k hemolýze: - velmi záleží na množství komplementu – každý vzorek se musí titrovat, aby bylo množství komplementu konstantní - použití: • diagnostika příjice /syfilis/, bruceózy, pasteurely • ve virologii průkaz protilátek téměř všech virových nákaz • typizace neznámých Ag nově izolovaných virů • průkaz protiorgánových Ab Vyšetření komplementového systému a) Stanovují se hladiny jednotlivých složek K v séru – za pomoci antisér, většinou proti C3, C4, C1q b) Celková aktivita komplementové kaskády-se provádí testem CH50 – (50% hemolýza způsobená komplementem), stupeň hemolýzy závisí na množství přidaného K, nepřímá úměra, hemolýza - spektrofotometrie Využití: K detekci poruch nedostatečného mn. nebo defektů složek K systému Vyšetření cirkulujících a deponovaných IK Principy metodik 1. Využívající fyz – chem vlastností – CIK- největší makromolekuly séra mohou být preciptovány pomocí PEG (polyetylénglykol). Precipitát je úměrný mn. cirkulujících CIK Vyšetření komplementového systému ̶ 2. CIK na sebe váží C1 – C3 složky K. V první fázi se odstraní nenavázaný C1q. V druhé fázi se stanoví koncentrace C1q, jež odráží i hladinu CIK (totéž pro C3,C4) ̶ 3. průkaz vazbou na buňky, které exprimují receptor pro Fc gragment IgG. Lze využít trombocyty ̶ Využití: Pro monitoring jakýchkoliv zánětlivých procesů. Pro diagnostiku imunokomplexových chorob je důležitější průkaz IK deponovaných v tkáních. To se provádí po bioptickém odběru vzorku z tkáně (kůže, svaly, ledviny) pomocí přímé fluorescence se prokazuje uložení IgG Při běžné elfo se sérum dělí na zónu albuminu, α – 1, α – 2, β, γ globulinů. Stanovení zastoupení jednotlivých frakcí může mít význam při hodnocení stádia zánětlivého procesu. Při akutních zánětech stoupá zastoupení albumínů a α – 1, později i α – 2 globulinů, při chronických zánětech dochází ke zvýšení zastoupení γ globulinů a poklesu albuminu Elfo sérových proteinů Metody imunoelektroforézy Imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA: • 1953 Williams a Grabar • 2 stupně: 1. nalití destičky ( agarózní gel s pufrem ) vytvoření 2 žlábků a nanesení Ag mezi ně • po rozdělení elektroforézou se do žlábků 2. napipetují protilátky • inkubace 48 hodin v lednici → dochází k DIFUZI • → v místě ekvivalence se vytváří PRECIPITAČNÍ obloučky Raketová elfo • Laurell 1966 • kombinace jednoduché radiální imunodifúze s elektroforézou • - monospecifická Ab + jeden Ag /či směs Ag/ Ab v gelu užívá se pro zjišťování koncentrace Ag – koncentrace je přímo úměrná výšce „raketky“ Imunofixace Rozdělení různých proteinů na základě jejich pohyblivosti v el. poli modifikační metodou 1. stupeň: Elfo vyšetřovaného séra 2. Stupeň: na agarózu se položí plastikované maska s výřezy, naplní se s antiséry (anti IgG, IgA, IgM, anti kappa, anti lambda), pak porovnání s precip. reakce s normálním sérem, TSP – testovaná séra pacientů Hodnocení a)Okometricky b)denzitometricky Metody separace buněk Používají se tzv. selekční protilátky, které jsou pevně navázány na magnetické částice. Používá se v pozitivním nebo negativním uspořádání Pozitivní separace spočívá ve výběru buněk podle přítomnosti určitého znaku (povrchové molekuly) Negativní spočívá v odstranění všech, které specifický znak nenesou. pozitivní negativní Gradientová separace ery plus granulocyty histopaque Hledaná vrstva mono plus lymfocyty Plasma plus tromb. Metoda založená na rozdílné hustotě buněk. Navrstvení heparinizované krve na separační gradient (např. dextran, Ficoll, Histopaque). Po následné centrifugaci dojde k typickému rozdělení buněk Velikost útvarů v počítací sítu Pravidlo pro počítání částic v počítací komůrce. Do celkového počtu částic se započítávají pouze ty, které leží nebo se dotýkají dvou zvolených stran, v tomto případě horní a levá (označeny černě). Částice dotýkající se pravé a spodní strany nezapočítáváme (označeny šedě). Počítací síť Bürkerovy komůrky Počet před separací v plné krvi – leukocyty Zjištěná hodnota se musí ještě přepočítat pro lymfocyty Zjišťování počtu leukocytů, krevní diferenciál Metody fagocytózy ̶ VYUŽITÍ v praxi : ̶ zjištění :  nedostatečnosti či poruch jednotlivých fází fagocytózy ̶  aktivity fagocytů u pacientů s opakovanými infekcemi, opakovanou léčbou antibiotiky, nádorovým onemocněním, artritidou či revmatoidními onemocněními, při zátěžových situacích Testy na metabolickou aktivitu LEU, NBT test hodnocení: - pod vlivem CHTS při kultivaci dojde k fagocytóze, jejíž součástí je oxidativní vzplanutí -Redukce vlivem oxidačních pochodů v buňce. NBT nitroblue tetrazolium chlorid bezbarvý se změní na modrý formazán – stanovení SPEKTROFOTOMETREM -Touto metodou se prokazuje hlavně schopnost fagocytů tvořit kyslíkové radikály aktivací NADPH oxidázy redukce CHEMILUMINISCENČNÍ test pro kvantitativní hodnocení oxidativního vzplanutí Vznikají elektronově excitované stavy, které emitují fotony. Emitované fotony zachycovány tzv. luminoforem (luminol, izoluminol nebo lucigenin), spontánní a aktivovaná CL (pomocí zymozanu), luminometr NADPH oxidáza O2 + el O2 - . radikál, anion Dalšími reakcemi vznik kyslíkových radikálů luminometr plus luminol CHEMOTAKTICKÝ STIMUL vnitřní – produkty vlastních BB – komplement, imunokomplex, IL, prostaglandiny vnější – produkty ze stěn mikrobů – lipopolysacharid, GLP, manan Metody stanovení protilátek metody souhrnně ̶ Stanovení protilátek - základní imunologická vyšetření. ̶ stanovení kvantitativní, kvalitativní a stanovení specifických protilátek ̶ Metody: Imunodifúze - radiální ID Aglutinace RIA? FIA, EIA – ELISA Western blot Nefelometrie, turbidimetrie Fyziologické hodnoty množství protilátek v séru u člověka: IgG 8 – 18 g/l; IgA 0,9 – 3,5 g/l; IgM 0,9 – 2,5 g/l; IgD 0,1 g/l; IgE 0,0003 g/l Stanovení protilátek ̶ SÉROLOGICKÉ METODY - všechna stanovení protilátek v krevním séru, viz prezentace ̶ Příklady sérologických reakcí a způsobů vizualizace ̶ Aglutinace vizuálně hodnotitelný aglutinát ̶ Precipitace vizuálně hodnotitelný precipitát nefelometrické, resp, turbidimetrické hodnocení ̶ Komplement fixační reakce hemolýza erytrocytů ̶ Imunoelektroforéza precipitát antigenů nebo protilátek rozdělený v elektrickém poli Charakteristika vlastností tříd a podtříd Ig Obr. Ig v ontogenezi: přes placentu pasivně IgG do prorodu, v pozdních fázích těhotenství tvorba vlastních IgM, IgA pasivně v kolostru a mléku, ostatní či zvýšené hladiny značí intrauterinní infekce Dynamika primární a sekundární protilátkové odpovědi Obr. Primární odpověď 1. Tvorba Ab ve třídě IgM, potom další třídy a podtřídy (IgG, IgA..) 2. Postupné zvyšování afinity Ab podle procesu somatické mutace Sekundární odpověď 1. rychlejší a intenzivnější tvorba tříd IgG, IgA, nižší tvorba IgM 2. Vyšší afinita a množství Ab expanzí paměťových buněk, které již prodělaly proces somatické mutace Důležité pojmy z oblasti sérologie jsou: ̶ sérokonverze – zvýšení hladiny specifických protilátek, tento pojem zahrnuje dynamiku tvorby protilátek ̶ séropozitivita, ̶ séronegativita – přítomnost, resp. nepřítomnost specifických protilátek v séru ̶ sérorezistence – stav, kdy při léčbě zůstává séropozitivita bez klinických příznaků sérorecidiva – znovuobjevení pozitivity séra po přechodném vymizení specifických protilátek • ̶ sérotyp (sérovar) skupina původců onemocnění (obvykle podmnožinu bakteriálního druhu), která se od jiných zástupců téhož bakteriálního druhu dá odlišit právě na základě sérologické reakce. Vykazuje tedy určitou antigenní specifitu v rámci druhu. Další spec. stanovení ̶ Stanovení IgE ̶ Stanovení monoklonální (patologické) komponenty: při podezření na monoklonální gamapatie se stanovuje množství mono-, bi- nebo oligoklonálních protilátek, které jsou produkty jednoho nebo několika málo patologicky zmnožených klonů B lymfocytů (imunofixace). ̶ Stanovení kryoglobulinů (např. hematologické malignity, revmatoidní artritida, vaskulitidy, chronické zánětlivé stavy, vleklé infekce apod.). Stanovení za přísných teplotních podmínek 37°C (jinak precipitace) Imunitní systém ve zdraví a nemoci37 Zákalové reakce metoda probíhající v roztoku Princip: při reakci Ag a Ab vzniká zákal-precipitát, jehož intenzita je při konstantním množstvím mn. Ab úměrná koncentraci vyšetřovaného Ag NEFELOMETRIE – rozptyl monochrom. světla měřeného pod úhlem, měří se intenzita záblesků světla odraženého od IK (Tyndal. efekt), výbojka nebo laser TURBIDIMETRIE – úbytek monochrom. světla o 320nm při průchodu vzorkem v kyvetě měřeného ve stejné rovině Výhoda: možnost automatizace, rychlost provedení, přesnost, ale vyšší cena, dioda, méně přesná Imunofixace Rozdělení různých proteinů na základě jejich pohyblivosti v el. poli modifikační metodou 1. stupeň: Elfo vyšetřovaného séra 2. Stupeň: na agarózu se položí plastikované maska s výřezy, naplní se s antiséry (antiIgG, IgA, IgM, anti kappa, anti lambda), pak porovnání s precip. reakce s normálním sérem ,TSP – testovaná séra pacientů Hodnocení a)okometricky b)denzitometricky Metoda ELISA Sendvičová ELISA pro protilátky Neboli nepřímá ELISA na detekci Ab – slouží na důkaz neboli titraci Ab specifických pro určitý Ag. Použití: na titraci Ab třídy IgG + IgM. Antigen se naváže na tuhou fázi a promyje. Přidá se zředěné sérum, ve kterém se má určit přítomnost Ab. Inkubace, promytí – přitom dochází k navázání na imobilizované Ag Přidá se enzymem značená sekundární Ab, promytí Přidá se enzymový substrát a změří se intenzita barevné reakce. Další metody k doplnění: Metody tvorby monokl. Ab, FIA, RIA, EIA, používané v alergologii apod