CG080 Metody v genomice a proteomice

Přírodovědecká fakulta
jaro 2011 - akreditace
Rozsah
2/0. 2 kr. (plus 2 za zk). Ukončení: zk.
Vyučující
Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc. (přednášející)
doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Havliš, Dr. (přednášející)
doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D. (přednášející)
doc. RNDr. Jaromír Marek, Ph.D. (přednášející)
doc. Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (přednášející)
Garance
prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Ústav biochemie – Chemická sekce – Přírodovědecká fakulta
Předpoklady
základní znalosti analytické chemie, biochemie a molekulární biologie
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je otevřen studentům libovolného oboru.
Cíle předmětu
Na konci tohoto kurzu bude student schopen: vysvětlit principy základních metod pro studium genomu a proteomu; bude schopen navrhnout vhodný metodický postup pro analýzu daného typu vzorku s ohledem na účel analýzy
Osnova
  • genomika
  • Izolace DNA a RNA, Separace nukleových kyselin (elektroforéza) Metody izolace DNA/RNA: fenol/chloroformové extrakce, izopyknické centrifugace v gradientu CsCl či adsorbce na křemičité sklo v přítomnosti chaotropních solí. Metody kvatifikace (komparativní, spektrofotometrické). Specifika práce s komerčně dostupnými kity na izolaci DNA/RNA. Metody používané při separaci nukleových kyselin se zaměřením na gelovou elektroforézu (agarózová, akryamidová). Principy a separační vlastnosti gelů; méně používané typy elfo (např. low-melting a alkalické agarózy; denaturující či nedenaturujíci akrylamidové gely; PFGE, 2D elfo). Možná úskalí („troubleshoots“ jak izolace DNA/RNA tak elfo separace) a interpretace výsledků.
  • Manipulace s DNA (štěpení, klonování, značení, ...) - enzymy používané v molekulární biology (restrikční endonukleázy typu I, II, III; metylačně citlivé enzymy, izoschizomery). Vektory (bakteriofágy, plasmidy, cosmidy, umělé bakteriální a kvasinkové chromozómy). Klonování do plasmidu (ligace s tupými a kohezními konci, transformace s použitím chemicky kompetentních buněk, transformace elektroporací, screening). Radioaktivní a neradioaktivní metody značení nukleových kyselin.
  • Techniky založené na renaturaci DNA (Southern, northern, PCR, FISH, microarrays...) Princip analýzy DNA (Southern) a RNA (northern); specifika práce s RNA. Design experimentu – štěpení DNA metylačně citlivými restriktázami, elektroforéza, přenos DNA na membránu, značení sondy, hybridizace, interpretace výsledků. PCR – princip, historie, DNA polymerázy. Optimalizace PCR, PCR s teplotním gradientem. FISH – princip, použití, značení sond fluorescenčními barvivy. Fibre FISH, multiplex FISH, RNA FISH, barvení repetitivních sekvencí (centromery, telomery), použití v diagnostice. Microarrays – princip, výhody pro sériovou analýzu genové exprese, interpretace výsledků.
  • Sekvenování, analýza genové exprese – principy sekvenování (chemické, Sangerovo), automatické kapilární sekvenátory, moderní sekvenační platformy (next-generation sequencing). Analýza genové exprese na úrovni mRNA a proteinů, přístupy in vitro a in vivo. Alternativní sestřih a jeho analýza. RT-PCR v reálném čase a cDNA microarrays.
  • Mutanti a jejich využití v genomice: Základní přístupy funkční genomiky, přímá a revezní genetika. Inzerční mutageneze v přímé i reverzní genetice, EMS mutageneze, identifikace mutovaných lokusů pomocí pozičního klonování a sekvencování příští generace (next-gen sequencing). EMS mutageneze v reverzní genetice - tilling.
  • proteomika
  • Příprava proteinových izolátů a frakcionace/separace proteinů a peptidů - základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS-PAGE, 2-D gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky; separační postupy pro analýzu fosfoproteinů a glykosylovaných proteinů, vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorků
  • Hmotnostní spektrometrie proteinů - základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace (TOF, iontová past, FTMS, hybridní přístroje); metody identifikace proteinů; charakterizace modifikací proteinů; metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace)
  • analýza proteinových komplexů (izolace komplexů, cross-linking, analýza, ověření); následná a paralelní analýza, metody studia interakce protein-protein (Y2H; BiFC; mbSUS; MeRA; SEAM – značení myc, TAP, FLAG, His; využití iontové mobility); stechiometrie komplexů - kvantifikace proteinů a peptidů pomocí MS; struktura komplexů - zesíťování molekulárními pravítky, metody (FTICR MS)
  • Metody makromolekulární strukturní analýzy - krystalografické techniky, NMR, cirkulárně dichroická spektroskopie - výhody a nevýhody; základní postupy proteinové krystalografie - makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování.
  • Příprava rekombinantních proteinů – výběr hostitelského organismu pro expresi rekombinantních proteinů; expresní systém E.coli; struktura expresního vektoru; výběr hostitelského kmene E.coli s ohledem na možné problémy jako toxicita proteinu, využití kodonů, stabilita proteinu; cílená exprese proteinu; inkluzní tělíska a možnosti optimalizace exprese proteinu v rozpustné formě; zásady pro čištění proteinů; základni typy chromatografií; sledování čistoty proteinů; fúzní proteiny; afinitní purifikace; uchovávání čistých proteinů.
Výukové metody
přednášky
Metody hodnocení
závěrečný písemný test
Další komentáře
Výuka probíhá každý týden.
Předmět je zařazen také v obdobích jaro 2013, jaro 2014, jaro 2015, jaro 2016, jaro 2017, jaro 2018, jaro 2019, jaro 2020, jaro 2021, jaro 2022, jaro 2023, jaro 2024, jaro 2025.