Bi6725 Moderní metody buněčné biologie

Přírodovědecká fakulta
podzim 2010 - akreditace
Rozsah
0/2/0. 2 kr. (plus ukončení). Ukončení: kz.
Vyučující
prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc. (cvičící)
prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc. (cvičící)
RNDr. Miroslav Machala, CSc. (cvičící)
Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. (cvičící)
Mgr. Karel Souček, Ph.D. (cvičící)
prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D. (cvičící)
Garance
prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Předpoklady
Předmět navazuje a tvoří logický celek s cvičením Fyziologie živočichů a Speciální metody fyziologie živočichů.
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je určen pouze studentům mateřských oborů.
Mateřské obory/plány
Cíle předmětu
Na konci tohoto kurzu bude student schopen: provádět rutinně klasické i moderní techniky používané v základním i apolikovaném výzkumu (viz sylabus); využít metody a přístupy odrážející nejnovější trendy ve výzkumu molekul, specifických buněk a buněčných populací; použít získané manuální laboratorní dovednosti a dále je rozvíjet; vybrat si ze spektra technik tu nejvhodnější metodu podle znalostí získaných v rámci předmětu; pracovat v moderně vybavených pracovištích na základě zkušeností z práce v laboratořích Biofyzikálního ústavu AV ČR, v.v.i.; získat praktické znalosti využitelné při vypracovávání diplomových a dizertačních prací
Osnova
  • 1. Buněčné kultury
  • Stanovení počtu a viability buněk: ukázka vybavení laboratoře, obsluha flow boxu, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce, pasážování buněk, počítání částic na Coulter Counter, určení životnosti buněk barvením eosinem.
  • Detekce apoptotických buněk: stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI (fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem). Měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií.
  • Stanovení stupně diferenciace leukemických buněk: detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk myeloidní linii HL-60 průtokovou cytometrií pomocí přímé imunocytochemie s protilátkami značenými fluorescenčními barvivy. Stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy (zymosan, forbol myristat acetat, Ca2+ ionofor) na destičkovém luminometru.
  • Stanovení diferenciace buněk nádoru kolonu (linie HT-29): stanovení alkalické fosfatázy kolorimetricky (alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení).
  • 2. Fluorescenční a konfokální mikroskopie:
  • Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader, ve kterých je fluorescenčně značený gen a jinou fluorescenční značkou obarven celý chromozom, na kterém se daný gen nachází.
  • 3. Biochemické metody:
  • Příprava buněčného lyzátu pro Western blotting a izolaci RNA:
  • Metodika přípravy buněčného lyzátu pro detekci proteinů a pro izolaci RNA, stanovení koncentrace proteinů pomocí kitu Bio-Rad DC protein. Elektroforéza a transfer proteinů na membránu: separace stanoveného množství proteinů připravených v rámci předchozího cvičení pomocí SDS-PAGE, přenos na PVDF membránu pomocí semidry electroblotting.
  • Imunodetekce:
  • Imunodetekce beta-aktinu pomocí primární neznačené protilátky (anti-beta-aktin) a sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou ve vzorcích zpracovaných a separovaných v rámci předchozích cvičení, vizualizace bude provedena pomocí kitu ECL Plus.
  • Izolace celkové RNA, stanovení koncentrace a kvality:
  • Izolace RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace RNA a její čistota na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer.
  • ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda:
  • Stanovení tumor nekrotizujícího faktoru alfa pomocí komerčního kitu od firmy R&D system Duoset v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk THP-1 po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin.
Literatura
  • Cell culture and upstream processing. Edited by M. Butler. 1st ed. New York: Taylor & Francis, 2007, xiv, 187. ISBN 9780415399692. info
  • Mammalian cell culture : essential techniques. Edited by A. Doyle - J. B. Griffiths. Chichester: John Wiley & Sons, 1997, xv, 173. ISBN 0471970573. info
  • Cancer cell culture : methods and protocols. Edited by Simon P. Langdon. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004, xii, 360. ISBN 1588290794. info
  • Animal cell culture :a practical approach. Edited by R. Ian Freshney. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1992, xix, 329 s. ISBN 0-19-963213-8. info
  • Cell biological appplications of confocal microscopy. Edited by Brian Matsumoto. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press, 2002, xii, 507. ISBN 0125804458. info
  • Molecular cloning, A laboratory manual, Vol. 1-3, Eds. J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 2001
  • Short protocols in molecular biology, Vol. 1 and 2, 5th edition, John Wiley and Sons, Inc., 2002
  • Current protocols in cytometry, Vol. 1 and 2, Ed. J. P. Robinson, John Wiley and Sons, Inc., 1997
  • Methods in Cell Biology, Vol. 75, Cytometry, 4th edition, New developments, Eds. Z. Darzynkiewicz, M. Roederer, H. J. Tanke, Elsevier Academic Press, 2004
  • CROWTHER, John R. The ELISA guidebook. Totowa, N.J.: Humana Press, 2001, xi, 421. ISBN 0896037282. info
Výukové metody
Krátké teoretické přednášky a praktické procvičování speciálních úkolů; demonstrace měření u pokročilých složitých metod a přístrojů (vysokorychlostní sorter a vysokorozlišovací konfokální mikroskopie, HPLC); domácí úkoly; diskuse v hodině.
Metody hodnocení
Dodání vyhodnocených výsledků a protokolů se zodpovězenými otázkami, závěrečný písemný test.
Navazující předměty
Další komentáře
Předmět je vyučován každoročně.
Výuka probíhá každý týden.
Předmět je zařazen také v obdobích podzim 2007 - akreditace, jaro 2003, jaro 2004, jaro 2005, jaro 2006, podzim 2006, podzim 2007, podzim 2008, podzim 2009, podzim 2010, podzim 2011, podzim 2011 - akreditace, podzim 2012, podzim 2013, podzim 2014, podzim 2015, podzim 2016, podzim 2017.