Bi6725 Moderní metody buněčné biologie

Přírodovědecká fakulta
podzim 2016
Rozsah
0/2/0. 2 kr. (plus ukončení). Ukončení: kz.
Vyučující
prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc. (cvičící)
prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc. (cvičící)
Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. (cvičící)
Mgr. Karel Souček, Ph.D. (cvičící)
prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D. (cvičící)
doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D. (cvičící)
prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D. (cvičící)
Garance
prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Dodavatelské pracoviště: Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta
Rozvrh
Po 19. 9. až Ne 18. 12. St 15:00–16:50 D36/215
Předpoklady
Bi3030 Fyziologie živočichů
Předmět navazuje a tvoří logický celek s cvičením Fyziologie živočichů a Speciální metody fyziologie živočichů.
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je určen pouze studentům mateřských oborů.

Jiné omezení: Na předmět se vztahuje povinnost registrace, bez registrace může být znemožněn zápis předmětu!
Mateřské obory/plány
Cíle předmětu
Na konci tohoto kurzu bude student schopen: provádět rutinně klasické i moderní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu (viz sylabus); využít metody a přístupy odrážející nejnovější trendy ve výzkumu molekul, specifických buněk a buněčných populací; použít získané manuální laboratorní dovednosti a dále je rozvíjet; vybrat si ze spektra technik tu nejvhodnější metodu podle znalostí získaných v rámci předmětu; pracovat v moderně vybavených pracovištích na základě zkušeností z práce v laboratořích Biofyzikálního ústavu AV ČR, v.v.i.; získat praktické znalosti využitelné při vypracovávání diplomových a dizertačních prací
Osnova
  • 1. Cytokinetické parametry buněk (prof. Hofmanová, BFU AV ČR, v.v.i.) Teorie: Kultivace a využití buněčných kultur, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce v laboratoři, obsluha flow boxu, pasážování buněk, cytokinetické parametry (proliferace, diferenciace, apoptóza) a metody jejich jejich detekce. Experimenty: Stanovení počtu a viability buněk pomocí přístroje CASY, stanovení stupně diferenciace metodou ALP, detekce apoptotických buněk pomocí DAPI. 2. Hmotnostní spektrometrie a separační techniky (doc. Cigánek, VuVeL) Teorie: Separační techniky, kapalinová chromatografie, HPLC, hmotnostní spektrometrie, kombinace se separačními technikami, vhodné analyty, princip ionizace vzorku, typy analyzátorů. Praktická ukázka v laboratoři: GC/MS a jeho využití pro biologické aplikace, LC/MS-MS a její využití pro metabolomiku a využití LC/HybridMS v lipidomice. 3. Izolace RNA (doc. Vondráček, BFU AV ČR, v.v.i.) Teorie: Důvody izolace RNA, RNázy a ochrana před jejich působením, izolace RNA organickou extrakcí, afinitní purifikace RNA, izolace mRNA pomocí kitu, stanovení koncentrace a čistoty a stability izolované RNA. Experiment: Buňky hepatocelulárního karcinomu HepG2 ovlivněné a neovlivněné 10 nM TCDD po 24 hod, izolace celkové RNA pomocí kolonového kitu. 4. Průtoková cytometrie (Dr. Souček, BFU AV ČR, v.v.i.) Teorie: Principy průtokové cytometrie a detekce fluorescenčního signálu, využití pro různé částice, příprava materiálu pro průtokovou cytometrii, sortrování buněk, vícebarevné analýzy, analýza buněčného cyklu, fluorescenční proteiny. Praktická ukázka v laboratoři: Separace a následný sorting živých a mrtvých buněk na základě propustnosti barviva propidium jodid. 5. Transfekce (Dr. Medalová, FIŽ, MU) Teorie: Principy transfekce, používané vektory, stabilní vs. transientní transfekce, nejčastěji používané metody transfekce, jejich výhody a nevýhody, specifické metody transfekce, možnosti využití transfekčních technik. Principy konfokální mikroskopie a výhody jejího použití ve srovnání s běžnou fluorescenční mikroskopií. Experiment: Transfekce buněk HEK293 plazmidem nesoucím eGFP protein pomocí nejčastěji používaných metod (kationické polymery, lipofekce, fugene, elektroporace, nukleofekce) a hodnocení účinnosti transfekce pomocí fluorescenčního mikroskopu a průtokovou cytometrií. Praktická ukázka snímání obrazu na konfokálním mikroskopu včetně optimalizace získaných výsledků. 6. Nukleární magnetická rezonance (NMR) (doc. Žídek, CEITEC) Teorie: Princip NMR - interakce jádra s nenulovým spinem v magnetickém poli, magnetická pole v molekule a jejich interakce s ostatními jádry a elektrony, využití těchto interakcí a vztahů pro NMR, kvantifikace výsledků pomocí známých vzdáleností protonů, vzorky vhodné pro NMR, využití NMR pro analýzu struktury molekul. Praktická ukázka v laboratoři: konstrukce NMR spektrometru, nastavení základních experimentů, zpracování dat a ukázka spekter. 7. qRT-PCR (Dr. Medalová, FIŽ, MU) Teorie: Zpětný přepis mRNA do cDNA, namnožení cDNA pomocí real time cykleru, metody kvantifikace produktu pomocí fluorescence snímané po každém proběhlém cyklu, typy qRT-PCR a jejich výhody, ověření specifity reakce pomocí tavné křivky, způsoby vyhodnocení výsledků, počítání koncentrací roztoků a ředění buněčných suspenzí, principy krájení řezů na kryostatu, výhody této metody vůči parafinovým vzorkům. Experiment: Přepis celkové RNA získané izolací v lekci 3 do cDNA. Získaná cDNA je použita pro kvantifikaci exprese proteinových transportérů rodiny ABC (ABC A1, ABC B1, ABC C1, ABC G2) a house-keeping genu HPRT pomocí LightCycleru a inkorporace fluorescenční značky SYBR green. Krájení kryořezů na kryostatu. 8. Genové inženýrství rostlin (doc. Hejátko, CEITEC) Teorie: Struktura genů, regulace transkripce, metody kvantitativní i kvalitativní analýzy genové exprese, DNA a proteinové chipy, next generation transkripční profilování, příprava translační a transkripční fúze analyzovaného genu s reportérem, identifikace mutantů se změnou expresního profilu využití internetových databází.
Literatura
  • Cell culture and upstream processing. Edited by M. Butler. 1st ed. New York: Taylor & Francis, 2007, xiv, 187. ISBN 9780415399692. info
  • Mammalian cell culture : essential techniques. Edited by A. Doyle - J. B. Griffiths. Chichester: John Wiley & Sons, 1997, xv, 173. ISBN 0471970573. info
  • Cancer cell culture : methods and protocols. Edited by Simon P. Langdon. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004, xii, 360. ISBN 1588290794. info
  • Animal cell culture :a practical approach. Edited by R. Ian Freshney. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1992, xix, 329 s. ISBN 0-19-963213-8. info
  • Cell biological appplications of confocal microscopy. Edited by Brian Matsumoto. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press, 2002, xii, 507. ISBN 0125804458. info
  • Molecular cloning, A laboratory manual, Vol. 1-3, Eds. J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 2001
  • Short protocols in molecular biology, Vol. 1 and 2, 5th edition, John Wiley and Sons, Inc., 2002
  • Current protocols in cytometry, Vol. 1 and 2, Ed. J. P. Robinson, John Wiley and Sons, Inc., 1997
  • Methods in Cell Biology, Vol. 75, Cytometry, 4th edition, New developments, Eds. Z. Darzynkiewicz, M. Roederer, H. J. Tanke, Elsevier Academic Press, 2004
  • CROWTHER, John R. The ELISA guidebook. Totowa, N.J.: Humana Press, 2001, xi, 421. ISBN 0896037282. info
Výukové metody
Krátké teoretické přednášky a praktické procvičování speciálních úkolů; demonstrace měření pokročilých složitých metod a přístrojů; domácí úkoly; diskuse vhodině.
Metody hodnocení
Pro absolvování kurzu musí studenti dodat zadané protokoly s vyhodnocenými výsledky a zodpovězenými otázkami. Kurz je zakončen závěrečným písemným testem z probraných metod. Sestává obvykle z 20 otázek, z nichž alespoň 60% musí být správně zodpovězeno.
Navazující předměty
Další komentáře
Studijní materiály
Předmět je vyučován každoročně.
Předmět je zařazen také v obdobích podzim 2007 - akreditace, podzim 2010 - akreditace, jaro 2003, jaro 2004, jaro 2005, jaro 2006, podzim 2006, podzim 2007, podzim 2008, podzim 2009, podzim 2010, podzim 2011, podzim 2011 - akreditace, podzim 2012, podzim 2013, podzim 2014, podzim 2015, podzim 2017.