Bi5599c Metody aplikované biochemie a buněčné biologie - cvičení

Přírodovědecká fakulta
podzim 2018
Rozsah
0/2/0. 2 kr. (plus ukončení). Ukončení: z.
Vyučující
Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. (cvičící)
prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc. (cvičící)
doc. Mgr. Karel Souček, Ph.D. (cvičící)
prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D. (cvičící)
doc. RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. (cvičící)
RNDr. Vendula Hlaváčková Pospíchalová, Ph.D. (cvičící)
Garance
prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D.
Dodavatelské pracoviště: Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta
Předpoklady
Bi3030 Fyziologie živočichů && NOW( Bi5599 Metody bioch. a buň. biologie )
Předmět navazuje a tvoří logický celek s cvičením Fyziologie živočichů a Speciální metody fyziologie živočichů.
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je určen pouze studentům mateřských oborů.

Jiné omezení: Na předmět se vztahuje povinnost registrace, bez registrace může být znemožněn zápis předmětu!
Mateřské obory/plány
Cíle předmětu
Cílem předmětu je naučit studenty: provádět rutinně klasické i moderní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu (viz "osnova"); využít metody a přístupy odrážející nejnovější trendy ve výzkumu molekul, specifických buněk a buněčných populací; použít získané manuální laboratorní dovednosti a dále je rozvíjet; vybrat si ze spektra technik tu nejvhodnější metodu pro vlastní experimenty podle znalostí získaných v rámci předmětu; pracovat v moderně vybavených pracovištích Oddělení fyzilogie a imunologie živočichů; získat praktické znalosti využitelné při vypracovávání diplomových a dizertačních prací
Výstupy z učení
Na konci tohoto kurzu bude student schopen: provádět rutinně klasické i moderní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu (viz "osnova"); využít metody a přístupy odrážející nejnovější trendy ve výzkumu molekul, specifických buněk a buněčných populací; použít získané manuální laboratorní dovednosti a dále je rozvíjet; vybrat si ze spektra technik tu nejvhodnější metodu podle znalostí získaných v rámci předmětu; pracovat v moderně vybavených pracovištích na základě zkušeností z práce v laboratořích Oddělení fyziologie a imunologie živočichů; získat praktické znalosti využitelné při vypracovávání diplomových a dizertačních prací
Osnova
  • 1. Kultivace buněčných linií Kultivace a využití buněčných kultur, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce v laboratoři buněčných kultur, obsluha flow boxu, udržení sterility, pasážování buněk. 2. Ovlivnění aktivity beta kateninu Transfekce reportérových plazmidů do buněk HEK 293 pro stanovení účinnosti transfekce a aktivity beta kateninu. Ovlivnění aktivity beta kateninu pomocí TetON systému a stimulačních (Wnt) a inhibičních molekul (R-spondin1). 3. Izolace RNA Izolace mRNA pomocí kolonkového kitu, stanovení koncentrace a čistoty izolované RNA na modelu buněk HEK 293 s různou aktivitou beta kateninu. 4. qRT PCR Aktivitu beta kateninu je možné stanovit pomocí detekce molekul mRNA pro geny, do jejichž promotoru se beta catenin váže a podporuje tak jejich přepis do mRNA (axin 2, cMyc). Pro stanovení množství těchto molekul je nutné nejprve přepsat mRNA do cDNA a namnožit specifické cDNA pomocí real time cykleru. Kvantifikace produktu pomocí fluorescence snímané po každém proběhlém cyklu, ověření specifity reakce pomocí tzv. melting curve, vyhodnocení výsledků různými způsoby. 4. Hodnocení úspěšnosti transfekce pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie Buňky HEK 293 budou spolu s ostatními plazmidy transfekovány plazmidem nesoucím gen pro GFP. Předpokládá se, že všechny plazmidy jsou inkorporovány a přepisovány stejně efektivně, proto stanovení procenta GFP pozitivních buněk odpovídá účinnosti proběhlé transfekce. Pomocí fluorescenční mikroskopie budou nasnímány 4 snímky z různých částí inkubační misky, následně bude stanoven poměr GFP pozitivních buněk k všem buňkám v daném zorném poli. Správnost výpočtu bude ověřena pomocí následné trypsinizace a stanovení GFP pozitivních buněk pomocí průtokové cytometrie. 5. Top Flash Nejpřesnějším hodnocením aktivity beta kateninu je využití reportérového konstruktu promotoru pro tento transkripční faktor konjugovaného s genem pro luciferázu pocházejícím ze světlušek. Spolu s tímto konstruktem byl do buněk transfekován také plazmid nesoucí luciferázu z korálnatce renilly, který se přepisuje ve všech transfekovaných buňkách. Aktivitu beta kateninu v natransfekovaných buňkách tak můžeme vyjádřit jako poměr luminiscence světluškové luciferázy ku renillové luciferáze. 6. Western blotting Analýza proteinů pomocí elektroforetické separace v PAGE, následovaná přesátím proteinů na membránu pomocí mokrého blottingu a imunodetekcí cílových proteinů, patří již po desítky let k základním laboratorním metodám. Pomocí protilátky specificky detekující aktivní formu beta kateninu a protilátky proti celkovému beta kateninu je možné také stanovit relativní množství tohoto proteinu v jednotlivých vzorcích. Součástí experimentu bude také denzitometrie získaných "proužků". 7. Live Imaging Tato metoda využívá zabudování mikroskopu do inkubátoru, proto je možné sledovat rostoucí buňky i po dlouhou inkubační periodu. Budeme sledovat diferenciaci myoblastů v plnohodnotná syncitia. Pomocí sledování jednotlivých buněk v záznamu zjistíme, jak fúzují.
Literatura
  • Cell culture and upstream processing. Edited by M. Butler. 1st ed. New York: Taylor & Francis, 2007, xiv, 187. ISBN 9780415399692. info
  • Mammalian cell culture : essential techniques. Edited by A. Doyle - J. B. Griffiths. Chichester: John Wiley & Sons, 1997, xv, 173. ISBN 0471970573. info
  • Cancer cell culture : methods and protocols. Edited by Simon P. Langdon. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004, xii, 360. ISBN 1588290794. info
  • Animal cell culture :a practical approach. Edited by R. Ian Freshney. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1992, xix, 329 s. ISBN 0-19-963213-8. info
  • Cell biological appplications of confocal microscopy. Edited by Brian Matsumoto. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press, 2002, xii, 507. ISBN 0125804458. info
  • Molecular cloning, A laboratory manual, Vol. 1-3, Eds. J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 2001
  • Short protocols in molecular biology, Vol. 1 and 2, 5th edition, John Wiley and Sons, Inc., 2002
  • Current protocols in cytometry, Vol. 1 and 2, Ed. J. P. Robinson, John Wiley and Sons, Inc., 1997
  • Methods in Cell Biology, Vol. 75, Cytometry, 4th edition, New developments, Eds. Z. Darzynkiewicz, M. Roederer, H. J. Tanke, Elsevier Academic Press, 2004
  • CROWTHER, John R. The ELISA guidebook. Totowa, N.J.: Humana Press, 2001, xi, 421. ISBN 0896037282. info
Výukové metody
Krátké teoretické přednášky a praktické procvičování speciálních úkolů; demonstrace měření pokročilých složitých metod a přístrojů; domácí úkoly; diskuse v hodině.
Metody hodnocení
Pro absolvování kurzu musí studenti dodat zadané protokoly s vyhodnocenými výsledky a zodpovězenými otázkami. Kurz je zakončen závěrečným písemným testem z probraných metod. Sestává obvykle z 20 otázek, z nichž alespoň 60% musí být správně zodpovězeno.
Navazující předměty
Informace učitele
Cvičení proběhne formou blokové výuky, která se bude konat 4 dny v zápočtovém týdnu v prostorách oddělení fyziologie a imunologie živočichů (pavilon A36)
Další komentáře
Studijní materiály
Předmět je vyučován každoročně.
Výuka probíhá blokově.
Předmět je zařazen také v obdobích podzim 2019, podzim 2020, podzim 2021, podzim 2022, podzim 2023, podzim 2024.