CG090 Metody v proteomice

Přírodovědecká fakulta
jaro 2020
Rozsah
2/0/0. 2 kr. (plus 2 za zk). Ukončení: zk.
Vyučující
Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Havliš, Dr. (přednášející)
doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D. (přednášející)
Mgr. Tomáš Klumpler, Ph.D. (přednášející)
RNDr. Hana Konečná (přednášející)
doc. Mgr. Karel Kubíček, PhD. (přednášející)
Mgr. Gabriela Lochmanová, Ph.D. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat. (přednášející)
Mgr. David Potěšil, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (přednášející)
Garance
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
Národní centrum pro výzkum biomolekul – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
Dodavatelské pracoviště: Národní centrum pro výzkum biomolekul – Přírodovědecká fakulta
Rozvrh
Po 15:00–16:30 C02/211
Předpoklady
základní znalosti analytické chemie, biochemie a molekulární biologie
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je nabízen i studentům mimo mateřské obory.
Mateřské obory/plány
předmět má 6 mateřských oborů, zobrazit
Cíle předmětu
cílem tohoto předmětu je seznámit studenty obecně a souhrnně s metodami využívanými v proteomice.
Výstupy z učení
na konci tohoto kurzu bude student schopen:
vysvětlit principy základních metod pro studium proteomu
navrhnout vhodný metodický postup pro analýzu daného typu vzorku s ohledem na účel analýzy.
Osnova
  • lekce 1 Jan Havliš
  • Základy frakcionace/separace proteinů a peptidů – principy separace, fyzikálně chemické vlastnosti peptidů a proteinů, základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS-PAGE, 2-D gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky (IEC, RPLC, HILIC, HIC, SEC), predikce separačních vlastností
  • lekce 2 Jan Havliš
  • Afinitní chromatografie (IMAC, MOAC, lektinová LC), nekolonové separační techniky; vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorků (2D metody a kombinované techniky); příprava proteinového vzorku (vstupy, základní postup CIPP, centrifugace, kontrola postupu), příklad preparace enzymu, příklad preparace proteotypu S. cerevisiae, proteinové ekvalizéry, komerční izolační soustavy
  • lekce 3 Gabriela Lochmanová, Hana Konečná
  • 2-D gelová elektroforéza a analýza obrazu detailně – příprava na praktický kurs
  • lekce 4 Radka Dopitová
  • Úvod- rekombinantní proteiny, obecný postup jejich přípravy, kritéria pro výběr expresního systému; expresních systémy – bakteriální, kvasinkové, systémy využívající hmyzí buňky a bakulovirové vektory, ostatní
  • lekce 5 Radka Dopitová
  • Základní metody dezintegrace biomasy; purifikace rekombinantních proteinů – základní metody pro izolaci proteinů (afinitní, iontoměničová, hydrofobní a gelová permeační chromatografie), zásady pro řazení metod; afinitní kotvy a purifikace, základní postupy pro odstranění kotev
  • lekce 6 Tomáš Klumpler
  • Metody makromolekulární strukturní analýzy – rentgenové techniky: základní postupy proteinové krystalografie a maloúhlý rentgenový rozptyl - makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování.
  • lekce 7 Karel Kubíček
  • Základy NMR – stručný základ a rekapitulace základních principů jaderného spinu, magnetického pole, hardwarového vybavení NMR, porovnání kontinuální vlny s FT NMR; NMR při studiu struktury a dynamiky (bio)molekul; Studium interakcí pomocí NMR; Studium neuspořádaných proteinů pomocí 13C detekce.
  • lekce 8 Jan Paleček
  • Analýza protein-proteinových interakcí: metody využívající matrici/kuličky (pull-down, koimunoprecipitace), hybridní systémy (klasické, komplementační, membránové), metody proximity-based (FRET, PLA), mapování protein-proteinových interakcí (reverzní Y2H, peptidové knihovny protein painting, H-exchange)
  • lekce 9 Ctirad Hofr
  • Vazebná křivka; rovnovážná disociační konstanta; lineární rozsah detektoru; stanovení vazebné afinity fluorescenčně značných proteinů - fluorescenční anizotropie, mikrotermoforéza; detekce vazby molekul imobilizovaných na povrchu – povrchová plazmonová rezonance, ELISA; studium vazby nemodifikovaných proteinů přímo v roztoku - izotermální titrační kalorimetrie; případové studie použití kvantitativních metod analýzy interakce protein-protein; shrnutí praktických výhod a nevýhod jednotlivých metod.
  • lekce 10 Zbyněk Zdráhal
  • Hmotnostní spektrometrie proteinů – základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace (iontová past, TOF, Orbitrap, hybridní přístroje)
  • lekce 11 Zbyněk Zdráhal
  • Metody identifikace proteinů (bottom-up, top-down); charakterizace modifikací proteinů (např. fosforylace, acetylace, ubiquitinace); metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace, s použitím značek, label-free přístup)
  • lekce 12 David Potěšil
  • MS/MS data v proteomice (bottom-up vs. top-down proteomika, příklady bottom-up proteomických experimentů), příprava naměřených MS/MS dat, výběr a příprava proteinové databáze, databázové prohledání MS/MS dat ve velkém měřítku, zpracování výsledků databázového prohledání, rekonstrukce seznamu proteinů přítomných ve vzorku, kvantifikace proteinů a analýza kvantitativních informací, interpretace seznamu proteinů (biologické sítě).
Literatura
    doporučená literatura
  • BUDINSKA, Eva, Otakar FOJT a Ladislav DUŠEK. Bioinformatics in Genomics and Proteomics Data. 2009. URL info
  • TWYMAN, R.M. Principles of proteomics. BIOS Scientific Publishers, 2008. ISBN 1 85996 273 4. info
  • EIDHAMMER, Ingvar. Computational methods for mass spectrometry proteomics. Chichester: John Wiley & Sons, 2007, x, 284. ISBN 9780470512975. info
  • CAMPBELL, A. Malcolm a Laurie J. HEYER. Discovering genomics, proteomics, and bioinformatics. 2. ed. San Francisco: CSHL Press, 2007, xv, 447. ISBN 0805382194. info
  • Mass spectrometry data analysis in proteomics. Edited by Rune Matthiesen. Totowa, N. J.: Humana Press, 2007, x, 320. ISBN 9781588295637. info
  • THIELLEMENT, Hervé. Plant proteomics : methods and protocols. Totowa, N.J.: Humana Press, 2007, xiii, 399. ISBN 9781597452274. info
  • SIMPSON, Richard J. Proteins and proteomics : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, xiii, 926. ISBN 0879695544. info
  • Posttranslational modifications of proteins : tools for functional proteomics. Edited by Christoph Kannicht. Totowa, N.J.: Humana Press, 2002, xi, 322. ISBN 0896036782. info
  • Proteomics. Edited by Timothy Palzkill. Boston: Kluwer Academic Publishers, 2002, viii, 136. ISBN 0792375653. info
Výukové metody
výuka je založena na ppt prezentacích a jejich výkladu. prezentace budou dostupné jako studijní podklad (černobílý tisknutelný pdf s vysokým rozlišením a omezenými právy). vzhledem k výkladu, jenž prezentaci významně rozšiřuje, a neexistenci vhodných učebnic v českém jazyce pokrývajících některé části přednášky je vhodné přednášku navštěvovat. studenti si otestují získané znalosti pomocí testů nanečisto, které budou mít podobnou formu a obsah jako finální test, budou opraveny, ale ne známkovány.
Metody hodnocení
zkouška písemná; test se sestává ze šedesáti otázek, u každé otázky je vždy alespoň jedna správná odpověď ze čtyř variant. pro úspěšné absolvování je třeba zodpovědět minimálně 60 % otázek správně; test pokrývá celý obsah kurzu. zkouška bude završena ústní zkouškou.
Další komentáře
Studijní materiály
Předmět je vyučován každoročně.
Nachází se v prerekvizitách jiných předmětů
Předmět je zařazen také v obdobích jaro 2021, jaro 2022, jaro 2023, jaro 2024, jaro 2025.