PřF:Bi6725 Metody buň. biol - Informace o předmětu
Bi6725 Moderní metody buněčné biologie
Přírodovědecká fakultapodzim 2014
- Rozsah
- 0/2/0. 2 kr. (plus ukončení). Ukončení: kz.
- Vyučující
- prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc. (cvičící)
prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc. (cvičící)
Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. (cvičící)
doc. Mgr. Karel Souček, Ph.D. (cvičící)
prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D. (cvičící) - Garance
- prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: prof. RNDr. Alois Kozubík, CSc.
Dodavatelské pracoviště: Ústav experimentální biologie – Biologická sekce – Přírodovědecká fakulta - Rozvrh
- St 13:00–14:50 C05/114
- Předpoklady
- Bi3030 Fyziologie živočichů
Předmět navazuje a tvoří logický celek s cvičením Fyziologie živočichů a Speciální metody fyziologie živočichů. - Omezení zápisu do předmětu
- Předmět je určen pouze studentům mateřských oborů.
Jiné omezení: Na předmět se vztahuje povinnost registrace, bez registrace může být znemožněn zápis předmětu! - Mateřské obory/plány
- předmět má 9 mateřských oborů, zobrazit
- Cíle předmětu
- Na konci tohoto kurzu bude student schopen: provádět rutinně klasické i moderní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu (viz sylabus); využít metody a přístupy odrážející nejnovější trendy ve výzkumu molekul, specifických buněk a buněčných populací; použít získané manuální laboratorní dovednosti a dále je rozvíjet; vybrat si ze spektra technik tu nejvhodnější metodu podle znalostí získaných v rámci předmětu; pracovat v moderně vybavených pracovištích na základě zkušeností z práce v laboratořích Biofyzikálního ústavu AV ČR, v.v.i.; získat praktické znalosti využitelné při vypracovávání diplomových a dizertačních prací
- Osnova
- 1. Buněčné kultury
- Stanovení počtu a viability buněk: ukázka vybavení laboratoře, obsluha flow boxu, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce, pasážování buněk, počítání částic na Coulter Counter, určení životnosti buněk barvením eosinem.
- Detekce apoptotických buněk: stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI (fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem). Měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií.
- Stanovení stupně diferenciace leukemických buněk: detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk myeloidní linii HL-60 průtokovou cytometrií pomocí přímé imunocytochemie s protilátkami značenými fluorescenčními barvivy. Stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy (zymosan, forbol myristat acetat, Ca2+ ionofor) na destičkovém luminometru.
- Stanovení diferenciace buněk nádoru kolonu (linie HT-29): stanovení alkalické fosfatázy kolorimetricky (alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení).
- 2. Fluorescenční a konfokální mikroskopie:
- Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader, ve kterých je fluorescenčně značený gen a jinou fluorescenční značkou obarven celý chromozom, na kterém se daný gen nachází.
- 3. Biochemické metody:
- Příprava buněčného lyzátu pro Western blotting a izolaci RNA:
- Metodika přípravy buněčného lyzátu pro detekci proteinů a pro izolaci RNA, stanovení koncentrace proteinů pomocí kitu Bio-Rad DC protein. Elektroforéza a transfer proteinů na membránu: separace stanoveného množství proteinů připravených v rámci předchozího cvičení pomocí SDS-PAGE, přenos na PVDF membránu pomocí semidry electroblotting.
- Imunodetekce:
- Imunodetekce beta-aktinu pomocí primární neznačené protilátky (anti-beta-aktin) a sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou ve vzorcích zpracovaných a separovaných v rámci předchozích cvičení, vizualizace bude provedena pomocí kitu ECL Plus.
- Izolace celkové RNA, stanovení koncentrace a kvality:
- Izolace RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace RNA a její čistota na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer.
- ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda:
- Stanovení tumor nekrotizujícího faktoru alfa pomocí komerčního kitu od firmy R&D system Duoset v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk THP-1 po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin.
- Literatura
- Cell culture and upstream processing. Edited by M. Butler. 1st ed. New York: Taylor & Francis, 2007, xiv, 187. ISBN 9780415399692. info
- Mammalian cell culture : essential techniques. Edited by A. Doyle - J. B. Griffiths. Chichester: John Wiley & Sons, 1997, xv, 173. ISBN 0471970573. info
- Cancer cell culture : methods and protocols. Edited by Simon P. Langdon. Totowa, N.J.: Humana Press, 2004, xii, 360. ISBN 1588290794. info
- Animal cell culture :a practical approach. Edited by R. Ian Freshney. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1992, xix, 329 s. ISBN 0-19-963213-8. info
- Cell biological appplications of confocal microscopy. Edited by Brian Matsumoto. 2nd ed. Amsterdam: Academic Press, 2002, xii, 507. ISBN 0125804458. info
- Molecular cloning, A laboratory manual, Vol. 1-3, Eds. J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 2001
- Short protocols in molecular biology, Vol. 1 and 2, 5th edition, John Wiley and Sons, Inc., 2002
- Current protocols in cytometry, Vol. 1 and 2, Ed. J. P. Robinson, John Wiley and Sons, Inc., 1997
- Methods in Cell Biology, Vol. 75, Cytometry, 4th edition, New developments, Eds. Z. Darzynkiewicz, M. Roederer, H. J. Tanke, Elsevier Academic Press, 2004
- CROWTHER, John R. The ELISA guidebook. Totowa, N.J.: Humana Press, 2001, xi, 421. ISBN 0896037282. info
- Výukové metody
- Krátké teoretické přednášky a praktické procvičování speciálních úkolů; demonstrace měření u pokročilých složitých metod a přístrojů (vysokorychlostní sorter a vysokorozlišovací konfokální mikroskopie, HPLC); domácí úkoly; diskuse v hodině.
- Metody hodnocení
- Pro absolvování kurzu musí studenti dodat zadané protokoly s vyhodnocenými výsledky a zodpovězenými otázkami. Kurz je zakončen závěrečným písemným testem z probraných metod. Sestává obvykle z 10 otázek, z nichž alespoň 50% musí být správně zodpovězeno.
- Navazující předměty
- Další komentáře
- Studijní materiály
Předmět je vyučován každoročně.
- Statistika zápisu (podzim 2014, nejnovější)
- Permalink: https://is.muni.cz/predmet/sci/podzim2014/Bi6725