Licenci Mendelovu muzeu a Přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity poskytlo Cold Spring Harbor Laboratory
Informace v mRNA může být upravována
Jak praví dogma i čirá logika, mRNA je přesným obrazem sekvence DNA, ze které je přepisována. Tato jasná souvislost mezi sekvencí mRNA a DNA byla potvrzena při experimentech s bakteriálními buňkami (prokaryota). Na povrch však vyplynuly nesrovnalosti, když díky moderním technologiím přípravy rekombinantní DNA mohli vědci studovat i geny u složitějších buněk (eukaryot). Ukázalo se, že transkribovaná mRNA je ve skutečnosti kratší než odpovídající sekvence DNA příslušného genu. Rozdíl ve velikosti byl zřejmý i na snímcích z elektronového mikroskopu, na kterých je mRNA navázána na komplementární templátovou DNA. Na snímcích byly vidět v DNA smyčky v místech, ke kterým v DNA nebyla komplementární sekvence na mRNA.
Ve skutečnosti je totiž uložená informace o sekvenci proteinu v DNA přerušována nekódujícími oblastmi, které se označují jako introny. Tyto nekódující sekvence jsou přitom z mRNA vystřiženy. Kompletní informace v DNA je sice nejdříve věrně a „doslovně“ přepsána do dočasné molekuly RNA (tzv. pre-mRNA), ale tato pre-mRNA je však ještě v jádře upravena (sestřižena) za vzniku zralé mRNA. Celý proces sestřihu RNA zahrnuje odstranění nekódujících oblastí, intronů a následné spojení přiléhajících kódujících úseků, exonů.
Galerie
Věděli jste, že?
Koncem 70. let a začátkem 80. letech bylo CSHL (Cold Spring Harbor Laboratory) místem, kde se daly sehnat restrikční enzymy. Vědci, kteří se v CSHL scházeli při různých poradách, si přinášeli i zkumavky s DNA. Během přestávek pak navštěvovali laboratoř Riche Robertse, aby si otestovali své vzorky DNA restrikčními enzymy z jeho zásob.
Hmm…
Restrikční enzymy byly izolovány převážně z bakterií. Proč vůbec bakterie potřebují restrikční enzymy?
Video
Videa v této kapitole jsou v původním anglickém znění.
 |
Richard RobertsRich Roberts je ředitelem Research for New England Biolabs, jednoho z prvních komerčních prodejců restrikčních enzymů, který je dodnes vůdčím dodavatel chemikálií pro molekulární biologii. |
Popis prvních experimentálních důkazů o tom, že RNA transkript je zkrácený, což následně vedlo k návrhu studia na základě snímků z elektronového mikroskopu. Postup experimentu s elektronovým mikroskopem. Postup DNA/RNA hybridizačního pokusu a pozorování výsledků v elektronovém mikroskopu. Jak by doktorský student měl pokračovat v budování kariéry vědce? Hledáním a rozvíjením své vášně.
 |
Phil SharpPhil Sharp je profesorem biologie na Massachusetts Institute of Technology (MIT), kde také stále učí. V jeho laboratoři jsou studovány jak katalytické procesy zodpovědné za sestřih, tak i podstata faktorů navozujících specifitu tohoto procesu. |
Popisuje rozdíl mezi dlouhou jadernou a krátkou mRNA v cytoplazmě a o čem tyto rozdíly napovídají. Interpretace snímků z elektronového mikroskopu, které vedly k objevu složených genů.
Vynález technologií, které umožnily studium DNA fragmentů: agarózová gelová elektroforéza a restrikční enzymy. Popisuje, jaké je ve vědě opravdové vzrušení z toho, když nevíte, co se děje a stanete se toho součástí.
Richard Roberts a Phil Sharp získali v roce 1993 Nobelovu cenu za objev složených genů u eukaryotických buněk (split gene theory).
Richard John Roberts (1943–)
Richard (Rich) Roberts se narodil v anglickém Derby. Když mu byly čtyři roky, přestěhovala se rodina do Bathu. Jeho otec byl mechanikem a matka hospodyně. Otec Robertse v jeho zvídavosti velmi podporoval. Pomohl mu ve sklepě vybudovat chemickou laboratoř, ve které Roberts vyráběl a studoval různé ohňostroje a jiné chemikálie.
Tento zájem o chemii a navíc záliba ve hraní her a skládání puzzle ho nakonec dovedla ke kariéře vědce. Být vědcem bylo něco, jako stát se detektivem a řešit chemické puzzle ve světě vědy. Absolvoval bakalářské studium na Sheffield University v roce 1965 a pokračoval zde pod vedením svého profesora organické chemie. Roberts byl jedním z mála, kteří na řešení problémů pohlíželi jako na výzvu, spíše než jako na povinnost namáhavého studia.
Když končil svoje doktorské studium, přečetl si Roberts knihu Johna Kendrewa „Thread of Life: An Introduction to Molecular Biology“. Tento úvod historie rané krystalografie a molekulární biologie Robertsovi učaroval. Rozhodl se, že změní zaměření a našel si laboratoř se zaměřením na molekulární biologii. Poté, co získal titul Ph.D., nastoupil jako postdoktorand do laboratoří Jacka Stromingera na Harvardu.
Na Harvardu se naučil biochemický slang. Projekt, na němž pracoval, obnášel sekvenování tRNA zahrnuté v biosyntéze bakteriální buněčné stěny. Na základě literatury se rozhodl, že nejlepší pro tento účel bude využití radioaktivní metody sekvenace, kterou vyvinul Fred Sanger v Cambridge. Roku 1970 proto odešel do Cambridge, kde se techniku naučil, a když se vrátil, tak mnoho vědců z oboru naučil, jak sekvenovat pomocí Sangerovy metody.
Roku 1972 James Watson nabídl po desetiminutovém rozhovoru Robertsonovi místo v Cold Spring Harbor Laboratory. Watson po něm chtěl, aby nasekvenoval DNA viru SV40. Roberts místo přijal a začal zkoumat enzym endonukleáza R, o kterém slyšel od Dana Nathanse. Enzym štěpí DNA na specifické úseky. Roberts si uvědomil, že kdyby takových enzymů bylo víc, mohl by je použít pro „naštípání“ DNA na kratší úseky a tyto potom použít pro sekvenování. Brzy měla Robertsova laboratoř celou sbírku restrikčních enzymů. V průběhu 70. a na začátku 80. let bylo v Robertsově laboratoři izolováno 75 ze 100 známých enzymů.
Některé z těchto restrikčních enzymů byly použity pro zmapování adenovirové DNA v projektu, kterého se účastnil i Phil Sharp z laboratoře Joe Sambrooka. V roce 1974 začali Roberts a Richard Gelinas pracovat s mRNA adenoviru. Usoudili, že by mohli identifikovat promotor DNA tak, že budou sekvenovat 5‘ konec mRNA a potom z něj vytvoří mapu DNA. Promotor by se nacházel před 5’ koncem mRNA. V průběhu pokusu získali biochemický důkaz, že geny adenoviru jsou složené. Později navrhl Roberts pokusy s využitím elektronového mikroskopu, které vizuálně potvrdily jejich předpoklad. Richard Roberts a Phil Sharp v roce 1993 spolu získali Nobelovu cenu právě za objev složených genů.
Roberts dále pomáhal vytvořit jeden z prvních počítačových programů, který mapuje a analyzuje fragmenty restrikčních enzymů. Byl z prvních obhájců použití počítačů v molekulární biologii.
V roce 1992 se Roberts přestěhoval do New England Biolabs – do společnosti, kde je dnes jedním ze dvou ředitelů pro výzkum. Společnost kromě základního výzkumu také vyrábí a prodává chemikálie a je známá svými restrikčními enzymy.
Roberts je stále velkým milovníkem puzzle a her. Jeho oblíbenou hrou je kroket. Říká, že se při něm snoubí dovednosti z kulečníku se strategií šachu. Jeho talent přicházet věcem na kloub se mísí se suchým smyslem pro humor, jak je vidět z jeho fotky pro humorný vědecký kalendář "The Stud Muffins of Science 1997 Calendar" a také jeho každoročního výletu na Harvard University na udílení cen „Ig Nobel Awards“ (jedná se o opak Nobelových cen).
Phillip Allen Sharp (1944–)
Phillip (Phil) Sharp se narodil na venkově v Kentucky, USA. Vyrůstal na farmě, a ačkoliv ho samotná biologie hlouběji nezajímala, ve škole miloval hodiny přírodopisu a matematiky. Rodiče ho podporovali, aby pokračoval ve studiích a Sharp si na školné vydělal chovem dobytka a pěstováním tabáku.
Sharp navštěvoval Union College, malou školu svobodných řemesel. Vynikal v chemii a matematice a po bakalářském studiu pokračoval na University of Illinois. Jeho diplomová práce popisovala DNA, ale spíše z pohledu fyzikální chemie než experimentální molekulární biologie.
Roku 1966 pořádala Cold Spring Harbor Laboratory konferenci o genetickém kódu. Když si Sharp přečetl konferenční sborník, začala jej zajímat právě molekulární biologie a genetika. Když se v roce 1969 začal poohlížet po místě postdoktoranda, požádal o místo u Normana Davidsona v California Institute of Technology. Jeho žádosti bylo vyhověno. Laboratoř byla zaměřená na problematiku spojenou s fágovými a bakteriálními genomy. Sharp si osvojil techniku práce na elektronovém mikroskopu a testování hypotéz. Pracoval s plazmidy bakterií a zjistil, že plazmidy determinující pohlaví nebo nesoucí resistenci mají přenositelné elementy.
V roce 1971 získal další postdoktorandské místo v Cold Spring Harbor Laboratory. Jeho nadřízeným byl James Watson, ale jelikož byl neustále na Harvardu, pracoval Sharp spíše s Joem Sambrookem. Sharpa zajímala genová exprese, pracoval proto s jednoduchými viry jako SV40 a adenovirus. S pomocí restrikčních enzymů, které v té době byly zrovna objeveny, a upravenou technikou gelové elektroforézy zmapoval Sharp genom adenoviru. S kolegy poté zmapovali i mRNA adenoviru a genům přiřadili funkci.
Tyto pokusy začaly na Cold Spring Harbor a pokračovaly dále na Massachusetts Institute of Technology, kde v roce 1974 nabídli Sharpovi práci na Oddělení výzkumu rakoviny (Center for Cancer Research). Sharp a jeho kolegové si všimli, že dlouhá jaderná RNA se v cytoplazmě nevyskytuje. Domnívali se proto, že dlouhé jaderné mRNA jsou zpracovány do kratších úseků. Pomocí hybridizací RNA/DNA ukázali, že jaderná mRNA je zpracovávána a upravována. To vedlo k objevu složených genů a teorii genového sestřihu, za kterou Sharp získal Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu v roce 1993.
V roce 1978 založil Sharp se skupinkou dalších vědců, včetně Waltera Gilberta jednu z prvních biotechnologických společností, Biogen Inc. Dnes sídlí v Bostonu a je v současné době jedinou samostatnou biotechnologickou společností. Sharp je předsedou vědecké rady Biogenu a členem jejího představenstva.
Roku 1985 se Sharp stal poté, co Salvador Luria odešel do důchodu, ředitelem Oddělení výzkumu rakoviny (Center for Cancer Research). Roku 1991 rezignoval na pozici ředitele a stal se vedoucím Oddělení biologie na MIT. Na této pozici setrval do roku 1999, v současnosti je zde profesorem.
Kromě Nobelovy ceny vyhrál Sharp celou řadu dalších cen. Do roku 1995 byl členem redakční rady časopisu Cell a je členem mnoha vědeckých organizací jako Státní Akademie (National Academy) a American Philosophical Society. Byl členem Rady prezidentských poradců (President's Advisory Council) pro vědu a technologie a dále byl členem mnoha výběrových komisí a vládních grantových agentur, jako NIH.
Věděli jste, že?
Rich Roberts je jedním z prvních forenzních znalců v problematice DNA. Ověřil DNA podezřelých a svědčil u soudu o její pravosti a průkaznosti.
Hmmm…
Jak pozná buňka rozdíl mezi intronem a exonem? Jak složí buňka dohromady exony v mRNA ve správném pořadí?
Odkazy a literatura
Webová aplikace štěpící DNANa této stránce je možné vložit jakoukoli nukleotidovou sekvenci. Stránka k ní vytvoří mapu a vyhledá místa a restrikční enzymy, které mohou vloženou sekvenci štěpit. Rebase – databáze restrikčních enzymů
Databáze, kterou spravuje Dr. Rich Roberts a Dana Macelis v New England Biolabs. Rebase je vyhledávací databáze všech známých restrikčních enzymů. Jsou zde k nalezení informace o enzymech, podmínkách štěpení a odkazech na vědecké články.
- Alberts, Bruce et al., 1983, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc., New York.
- Dunn, L.C., 1991, A Short History of Genetics: The Development of Some of the Main Lines of Thought: 1864-1939, Iowa State University Press, Ames.
- Griffiths, Anthony, et al., 1996, An Introduction to Genetic Analysis, W. H. Freeman and Company, New York.
- Judson, Horace Freeland, 1979, The Eighth Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology, Simon and Schuster, New York.
- Lagerkvist, Ulf, 1998, DNA Pioneers and Their Legacy, Yale University Press, New Haven.
- Lewin, Benjamin, 1990, Genes IV, Oxford University Press, New York.
- Micklos, David A., and Freyer, G., 1990, DNA Science: A First Course in Recombinant DNA Technology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
- Rosenfield, Israel, Ziff, Edward, and Van Loon, Borin, 1983, DNA for Beginners, Writers and Readers Publishing, Inc.
- Watson, James D., Gilman, Michael, Witkowski, Jan, Zoller, Mark, 1982, Recombinant DNA, 2nd edition, W. H. Freeman and Company, New York.
- Witkowski, J. A., 1988, The Discovery of "Split" Genes: a Scientific Revolution, Trends in Biochemical Sciences, 13: 110-113.
ÚEB, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita |
Mendelovo muzeum, Masarykova univerzita |
Návrat na úvodní stránku webu, přístupnost |
| Servisní středisko pro e-learning na MU
| Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, 2013
Centrum interaktivních a multimediálních studijních opor pro inovaci výuky a efektivní učení | CZ.1.07/2.2.00/28.0041
