CG080 Metody v genomice a proteomice

Přírodovědecká fakulta
jaro 2019
Rozsah
2/0/0. 2 kr. (plus 2 za zk). Ukončení: zk.
Vyučující
Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc. (přednášející)
doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Havliš, Dr. (přednášející)
Mgr. Tomáš Klumpler, Ph.D. (přednášející)
RNDr. Hana Konečná (přednášející)
Mgr. Gabriela Lochmanová, Ph.D. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat. (přednášející)
doc. Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (přednášející)
Mgr. Markéta Žďárská, Ph.D. (přednášející)
Garance
prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Národní centrum pro výzkum biomolekul – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Dodavatelské pracoviště: Národní centrum pro výzkum biomolekul – Přírodovědecká fakulta
Rozvrh
Po 18. 2. až Pá 17. 5. Út 9:00–10:50 C02/211
Předpoklady
základní znalosti analytické chemie, biochemie a molekulární biologie
Omezení zápisu do předmětu
Předmět je nabízen i studentům mimo mateřské obory.
Mateřské obory/plány
Cíle předmětu
cílem tohoto předmětu je seznámit studenty obecně a souhrnně s metodami využívanými v genomice a proteomice.
Výstupy z učení
na konci tohoto kurzu bude student schopen:
vysvětlit principy základních metod pro studium genomu a proteomu
navrhnout vhodný metodický postup pro analýzu daného typu vzorku s ohledem na účel analýzy.
Osnova
  • genomika
  • Izolace DNA a RNA, Separace nukleových kyselin (elektroforéza) Metody izolace DNA/RNA: fenol/chloroformové extrakce, izopyknické centrifugace v gradientu CsCl či adsorbce na křemičité sklo v přítomnosti chaotropních solí. Metody kvatifikace (komparativní, spektrofotometrické). Specifika práce s komerčně dostupnými kity na izolaci DNA/RNA. Metody používané při separaci nukleových kyselin se zaměřením na gelovou elektroforézu (agarózová, akryamidová). Principy a separační vlastnosti gelů; méně používané typy elfo (např. low-melting a alkalické agarózy; denaturující či nedenaturujíci akrylamidové gely; PFGE, 2D elfo). Možná úskalí („troubleshoots“ jak izolace DNA/RNA tak elfo separace) a interpretace výsledků.
  • Manipulace s DNA (štěpení, klonování, značení, ...) - enzymy používané v molekulární biology (restrikční endonukleázy typu I, II, III; metylačně citlivé enzymy, izoschizomery). Vektory (bakteriofágy, plasmidy, cosmidy, umělé bakteriální a kvasinkové chromozómy). Klonování do plasmidu (ligace s tupými a kohezními konci, transformace s použitím chemicky kompetentních buněk, transformace elektroporací, screening). Radioaktivní a neradioaktivní metody značení nukleových kyselin.
  • Techniky založené na renaturaci DNA (Southern, northern, PCR, FISH, microarrays...) Princip analýzy DNA (Southern) a RNA (northern); specifika práce s RNA. Design experimentu – štěpení DNA metylačně citlivými restriktázami, elektroforéza, přenos DNA na membránu, značení sondy, hybridizace, interpretace výsledků. PCR – princip, historie, DNA polymerázy. Optimalizace PCR, PCR s teplotním gradientem. FISH – princip, použití, značení sond fluorescenčními barvivy. Fibre FISH, multiplex FISH, RNA FISH, barvení repetitivních sekvencí (centromery, telomery), použití v diagnostice. Microarrays – princip, výhody pro sériovou analýzu genové exprese, interpretace výsledků.
  • Sekvenování, analýza genové exprese – principy sekvenování (chemické, Sangerovo), automatické kapilární sekvenátory, moderní sekvenační platformy (next-generation sequencing). Analýza genové exprese na úrovni mRNA a proteinů, přístupy in vitro a in vivo. Alternativní sestřih a jeho analýza. RT-PCR v reálném čase a cDNA microarrays.
  • Mutanti a jejich využití v genomice: Základní přístupy funkční genomiky, přímá a revezní genetika. Inzerční mutageneze v přímé i reverzní genetice, EMS mutageneze, identifikace mutovaných lokusů pomocí pozičního klonování a sekvencování příští generace (next-gen sequencing). EMS mutageneze v reverzní genetice - tilling.
  • proteomika
  • Příprava proteinových izolátů a frakcionace/separace proteinů a peptidů - základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS-PAGE, 2-D gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky; separační postupy pro analýzu fosfoproteinů a glykosylovaných proteinů, vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorků
  • Hmotnostní spektrometrie proteinů - základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace (TOF, iontová past, FTMS, hybridní přístroje); metody identifikace proteinů; charakterizace modifikací proteinů; metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace)
  • analýza proteinových komplexů (izolace komplexů, cross-linking, analýza, ověření); následná a paralelní analýza, metody studia interakce protein-protein (Y2H; BiFC; mbSUS; MeRA; SEAM – značení myc, TAP, FLAG, His; využití iontové mobility); stechiometrie komplexů - kvantifikace proteinů a peptidů pomocí MS; struktura komplexů - zesíťování molekulárními pravítky, metody (FTICR MS)
  • Metody makromolekulární strukturní analýzy - krystalografické techniky, NMR, cirkulárně dichroická spektroskopie - výhody a nevýhody; základní postupy proteinové krystalografie - makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování.
  • Příprava rekombinantních proteinů – výběr hostitelského organismu pro expresi rekombinantních proteinů; expresní systém E.coli; struktura expresního vektoru; výběr hostitelského kmene E.coli s ohledem na možné problémy jako toxicita proteinu, využití kodonů, stabilita proteinu; cílená exprese proteinu; inkluzní tělíska a možnosti optimalizace exprese proteinu v rozpustné formě; zásady pro čištění proteinů; základni typy chromatografií; sledování čistoty proteinů; fúzní proteiny; afinitní purifikace; uchovávání čistých proteinů.
Literatura
    doporučená literatura
  • Evolutionary genomics and systems biology. Edited by Gustavo Caetano-Anolles. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2010, xix, 465 p. ISBN 0470195142. info
  • PEVSNER, Jonathan. Bioinformatics and functional genomics. 2nd ed. Hoboken, N.J.: Wiley-Blackwell, 2009, xxviii, 95. ISBN 9780470085851. info
  • BUDINSKA, Eva, Otakar FOJT a Ladislav DUŠEK. Bioinformatics in Genomics and Proteomics Data. 2009. URL info
  • Biotechnology and genomics. Edited by P. K. Gupta. 1st ed. Meerut, India: Rastogi Publications, 2009, 796 p. ISBN 9788171338450. info
  • TWYMAN, R.M. Principles of proteomics. BIOS Scientific Publishers, 2008. ISBN 1 85996 273 4. info
  • EIDHAMMER, Ingvar. Computational methods for mass spectrometry proteomics. Chichester: John Wiley & Sons, 2007, x, 284. ISBN 9780470512975. info
  • CAMPBELL, A. Malcolm a Laurie J. HEYER. Discovering genomics, proteomics, and bioinformatics. 2. ed. San Francisco: CSHL Press, 2007, xv, 447. ISBN 0805382194. info
  • Genomics. Edited by Isidore Rigoutsos - G. Stephanopoulos. New York: Oxford University Press, 2007, xxi, 314 p. ISBN 9780195300819. info
  • Mass spectrometry data analysis in proteomics. Edited by Rune Matthiesen. Totowa, N. J.: Humana Press, 2007, x, 320. ISBN 9781588295637. info
  • THIELLEMENT, Hervé. Plant proteomics : methods and protocols. Totowa, N.J.: Humana Press, 2007, xiii, 399. ISBN 9781597452274. info
  • Functional genomics : methods and protocols. Edited by Michael J. Brownstein - Arkady B. Khodursky. Totowa, N.J.: Humana Press, 2003, xii, 258. ISBN 1588292916. info
  • SIMPSON, Richard J. Proteins and proteomics : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003, xiii, 926. ISBN 0879695544. info
  • Posttranslational modifications of proteins : tools for functional proteomics. Edited by Christoph Kannicht. Totowa, N.J.: Humana Press, 2002, xi, 322. ISBN 0896036782. info
  • Proteomics. Edited by Timothy Palzkill. New York: Kluwer Academic Publishers, 2002, viii, 127. ISBN 0-306-46895-6. info
  • Comparative genomics : empirical and analytical approches to gene order dynamics, map alignment and the evolution of gene families. Edited by David Sankoff - J. H. Nadeau. 1st ed. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2000, xiii, 557. ISBN 0792365844. info
  • Functional genomics : a practical approach. Edited by Stephen P. Hunt - Rick Livesey. 1st ed. Oxford: Oxford University Press, 2000, xviii, 253. ISBN 9780199637744. info
Výukové metody
výuka je založena na ppt prezentacích a jejich výkladu. prezentace budou dostupné jako studijní podklad (černobílý tisknutelný pdf s vysokým rozlišením a omezenými právy). vzhledem k výkladu, jenž prezentaci významně rozšiřuje, a neexistenci vhodných učebnic v českém jazyce pokrývajících některé části přednášky je vhodné přednášku navštěvovat. studenti si otestují získané znalosti pomocí testů nanečisto, které budou mít podobnou formu a obsah jako finální test, budou opraveny, ale ne známkovány.
Metody hodnocení
zkouška písemná; test se sestává ze šedesáti otázek, u každé otázky je vždy alespoň jedna správná odpověď ze čtyř variant. pro úspěšné absolvování je třeba zodpovědět minimálně 60 % otázek správně; test pokrývá celý obsah kurzu. zkouška bude završena ústní zkouškou.
Další komentáře
Studijní materiály
Předmět je vyučován každoročně.
Předmět je zařazen také v obdobích jaro 2011 - akreditace, jaro 2013, jaro 2014, jaro 2015, jaro 2016, jaro 2017, jaro 2018, jaro 2020, jaro 2021, jaro 2022, jaro 2023, jaro 2024, jaro 2025.