PřF:CG080 Genomika a proteomika - Informace o předmětu
CG080 Metody v genomice a proteomice
Přírodovědecká fakultajaro 2013
- Rozsah
- 2/0. 2 kr. (plus 2 za zk). Ukončení: zk.
- Vyučující
- Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc. (přednášející)
doc. Mgr. Miloslava Fojtová, CSc. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Havliš, Dr. (přednášející)
doc. RNDr. Jan Hejátko, Ph.D. (přednášející)
doc. RNDr. Jaromír Marek, Ph.D. (přednášející)
doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat. (přednášející)
doc. Mgr. Petra Procházková Schrumpfová, Ph.D. (přednášející)
prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. (přednášející)
Mgr. Markéta Žďárská, Ph.D. (přednášející) - Garance
- prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Ústav biochemie – Chemická sekce – Přírodovědecká fakulta
Kontaktní osoba: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
Dodavatelské pracoviště: Ústav biochemie – Chemická sekce – Přírodovědecká fakulta - Rozvrh
- Út 9:00–10:50 C02/211
- Předpoklady
- základní znalosti analytické chemie, biochemie a molekulární biologie
- Omezení zápisu do předmětu
- Předmět je nabízen i studentům mimo mateřské obory.
- Mateřské obory/plány
- Genomika a proteomika (program PřF, N-BCH)
- Cíle předmětu
- Na konci tohoto kurzu bude student schopen: vysvětlit principy základních metod pro studium genomu a proteomu; bude schopen navrhnout vhodný metodický postup pro analýzu daného typu vzorku s ohledem na účel analýzy
- Osnova
- genomika
- Izolace DNA a RNA, Separace nukleových kyselin (elektroforéza) Metody izolace DNA/RNA: fenol/chloroformové extrakce, izopyknické centrifugace v gradientu CsCl či adsorbce na křemičité sklo v přítomnosti chaotropních solí. Metody kvatifikace (komparativní, spektrofotometrické). Specifika práce s komerčně dostupnými kity na izolaci DNA/RNA. Metody používané při separaci nukleových kyselin se zaměřením na gelovou elektroforézu (agarózová, akryamidová). Principy a separační vlastnosti gelů; méně používané typy elfo (např. low-melting a alkalické agarózy; denaturující či nedenaturujíci akrylamidové gely; PFGE, 2D elfo). Možná úskalí („troubleshoots“ jak izolace DNA/RNA tak elfo separace) a interpretace výsledků.
- Manipulace s DNA (štěpení, klonování, značení, ...) - enzymy používané v molekulární biology (restrikční endonukleázy typu I, II, III; metylačně citlivé enzymy, izoschizomery). Vektory (bakteriofágy, plasmidy, cosmidy, umělé bakteriální a kvasinkové chromozómy). Klonování do plasmidu (ligace s tupými a kohezními konci, transformace s použitím chemicky kompetentních buněk, transformace elektroporací, screening). Radioaktivní a neradioaktivní metody značení nukleových kyselin.
- Techniky založené na renaturaci DNA (Southern, northern, PCR, FISH, microarrays...) Princip analýzy DNA (Southern) a RNA (northern); specifika práce s RNA. Design experimentu – štěpení DNA metylačně citlivými restriktázami, elektroforéza, přenos DNA na membránu, značení sondy, hybridizace, interpretace výsledků. PCR – princip, historie, DNA polymerázy. Optimalizace PCR, PCR s teplotním gradientem. FISH – princip, použití, značení sond fluorescenčními barvivy. Fibre FISH, multiplex FISH, RNA FISH, barvení repetitivních sekvencí (centromery, telomery), použití v diagnostice. Microarrays – princip, výhody pro sériovou analýzu genové exprese, interpretace výsledků.
- Sekvenování, analýza genové exprese – principy sekvenování (chemické, Sangerovo), automatické kapilární sekvenátory, moderní sekvenační platformy (next-generation sequencing). Analýza genové exprese na úrovni mRNA a proteinů, přístupy in vitro a in vivo. Alternativní sestřih a jeho analýza. RT-PCR v reálném čase a cDNA microarrays.
- Mutanti a jejich využití v genomice: Základní přístupy funkční genomiky, přímá a revezní genetika. Inzerční mutageneze v přímé i reverzní genetice, EMS mutageneze, identifikace mutovaných lokusů pomocí pozičního klonování a sekvencování příští generace (next-gen sequencing). EMS mutageneze v reverzní genetice - tilling.
- proteomika
- Příprava proteinových izolátů a frakcionace/separace proteinů a peptidů - základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS-PAGE, 2-D gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky; separační postupy pro analýzu fosfoproteinů a glykosylovaných proteinů, vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorků
- Hmotnostní spektrometrie proteinů - základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace (TOF, iontová past, FTMS, hybridní přístroje); metody identifikace proteinů; charakterizace modifikací proteinů; metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace)
- analýza proteinových komplexů (izolace komplexů, cross-linking, analýza, ověření); následná a paralelní analýza, metody studia interakce protein-protein (Y2H; BiFC; mbSUS; MeRA; SEAM – značení myc, TAP, FLAG, His; využití iontové mobility); stechiometrie komplexů - kvantifikace proteinů a peptidů pomocí MS; struktura komplexů - zesíťování molekulárními pravítky, metody (FTICR MS)
- Metody makromolekulární strukturní analýzy - krystalografické techniky, NMR, cirkulárně dichroická spektroskopie - výhody a nevýhody; základní postupy proteinové krystalografie - makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování.
- Příprava rekombinantních proteinů – výběr hostitelského organismu pro expresi rekombinantních proteinů; expresní systém E.coli; struktura expresního vektoru; výběr hostitelského kmene E.coli s ohledem na možné problémy jako toxicita proteinu, využití kodonů, stabilita proteinu; cílená exprese proteinu; inkluzní tělíska a možnosti optimalizace exprese proteinu v rozpustné formě; zásady pro čištění proteinů; základni typy chromatografií; sledování čistoty proteinů; fúzní proteiny; afinitní purifikace; uchovávání čistých proteinů.
- Literatura
- Real-time PCR. Edited by M. Tevfik Dorak. New York: Taylor & Francis, 2006, xxvi, 333. ISBN 041537734X. info
- ŠMAJS, David, S.J. NORRIS a G.M. WEINSTOCK. Construction of Treponema pallidum BAC library for functional and genomic apllications. In: Zhao,S. et al. (eds): Methods in Molecular Biology Series. Bacterial Artificial Chromosomes: Methods and Protocols. Washington, D.C. USA, 2002. info
- Výukové metody
- přednášky
- Metody hodnocení
- závěrečný písemný test
- Další komentáře
- Studijní materiály
Předmět je vyučován každoročně.
- Statistika zápisu (jaro 2013, nejnovější)
- Permalink: https://is.muni.cz/predmet/sci/jaro2013/CG080