Mezibuněčné interakce

v růstu a neoplasii

Vnitrobuněčné a molekulární změny v dělící se buňce jsou definovány poměrně rychle. Během posledních desítek let byla objevena řada genů souvisejících s karcinogenezí, tj. onkogenů a nádorových supresorů a objasněna jejich funkce. Navíc byly dokumentovány změny v expresi a aktivitě růstových faktorů, receptorů, uvolňování druhých poslů a genové exprese během růstu a neoplastické transformace. Mnohem méně definované jsou však mezibuněčné děje a procesy zahrnuté v růstu a neoplasii.

Chování buněk a rovnováha v buněčných populacích jsou regulovány komplexním integrovaným komunikačním systémem, který zahrnuje signály mimobuněčné, mezibuněčné a vnitrobuněčné (obr. 7-1).

Obr. 7-1 Tři hlavní způsoby mezibuněčné komunikace
(podle J.E.Trosko: Environmental Health Perspectives 1998 : 331)

Živočišné buňky obsahují systém proteinů, který jim umožňuje reagovat na signály jiných buněk. Zahrnuje receptorové proteiny na buněčném povrchu nebo uvnitř buněk (v cytoplasmě nebo v jádře) (obr. 7-2), proteinové kinázy, fosfatázy, proteiny vážící se na GTP a řadu dalších vnitrobuněčných proteinů, se kterými tyto signály interagují.

Obr. 7-2 Vazba mimobuněčných signálních molekul na povrchové nebo vnitrobuněčné receptory
(Figure 15-3. Molecular Biology of the Cell, 4^th Edition.)

Mezibuněčné interakce zahrnují (obr. 7-3)

• uvolnění růst modulujících faktorů do mezibuněčného prostoru (růstových faktorů, inhibitorů, eikosanoidů apod.) a ovlivnění sousedních buněk. Jsou to tzv. tkáňové mediátory působící parakrinní regulací.
• odpovědi buněk na složky buněčných membrán sousedních buněk a na složky mimobuněčné matrix. Patří sem i kadheriny a integriny důležité z hlediska metastatického procesu.
• přímý přenos signálů (malé molekuly asi 1 kDa) mezi buňkami prostřednictvím tzv. GJIC (gap junctional intercellular communication) realizovanou přímým propojením membrán sousedních buněk tzv. gap junctions. Poruchy GJIC vedou k poruchám rovnováhy v buněčných populacích a mohou vést k deregulaci růstu a k neoplasii.

Obr. 7-3 Formy mezibuněčných signálů
(Figure 15-4. Molecular Biology of the Cell, 4^th Edition.)

Modulace mimobuněčné a mezibuněčné komunikace buď genetickou nerovnováhou růstových faktorů, hormonů, neurotransmiterů nebo látkami z vnějšího prostředí (dieta, chem. látky) může spustit specifické signální vnitrobuněčné dráhy. Tyto signály pak modulují expresi genů a modulují též GJIC (obr. 7-4).

Obr. 7-4 Analogie signálních drah v buňkách
(paralelní a křížící se dráhy)

Poruchy mezibuněčné komunikace a GJIC řadíme k negenotoxickým mechanizmům karcinogeneze.

Buněčná komunikace a růstová kontrola

Karcinogeneze je několikastupňový proces, během něhož je porušena kontrola růstových mechanizmů, což odráží fakt, že geny kontrolující růst (onkogeny a geny suprimující nádory) jsou v nádorech často změněny. Růst buněk však není kontrolován jen geny, ale také různými formami mezibuněčných kontaktů. Je možné, že tyto buněčné kontakty hrají zásadní úlohu v regulaci onkogenů a supresorových genů. V epitelech, kde vzniká většina lidských nádorů je komunikace zprostředkovaná adhezívními molekulami (Cell Adhesion Molecules – CAM) a gap junction považována za velmi důležitou pro kontrolu růstu a diferenciace a tudíž i pro karcinogenezi.

Kadheriny jsou členové rodiny molekul, které určují specifické rozpoznávání buněk v tkáních mnohobuněčných organismů a hrají základní úlohu v buněčném vývoji. Aberantní exprese nebo funkce těchto molekul souvisí s invazivní a metastaticku fází karcinogeneze. Exprese a funkce E-kadherinu (a dalších proteinů) může být na různých úrovních ovlivněna karcinogeny a karcinogenními procesy. Rozpoznání buněk zprostředkované adhezívními molekulami předchází komunikaci prostřednictvím gap junction. Integriny pak zprostředkovávají kontakt buňka – mimobuněčná matrix (ECM). Tyto molekuly zprostředkovávají nejen adhezi, ale hrají důležitou roli v přenosu příslušných signálů mezi buňkami a mezi buňkami a ECM.

Význam GJIC

Buněčný růst a fenotyp jsou z části kontrolovány mezibuněčnou výměnou růstově regulačních faktorů prostřednictvím mezibuněčných spojení – gap junctions (GJ). Ty zprostředkovávají přímý tok malých molekul (méně než 1 kDa). Skládají se ze dvou spojených kanálů – konexonů složených ze 6 jednotek proteinů konexinů (obr. 7-5 a 7-6). Konexiny jsou členové multigenové rodiny a u mnoha byla klonována cDNA. Cytoplazmatická část konexinů je homologní se zbytkem molekul a obsahuje fosforylační místa na uhlíkovém konci (obr. 7-7). Konexiny tvořící GJ putují z endoplazmatického retikula do Golgiho aparátu. Vytvořené konexony jsou transportovány do plazmatické membrány, kde se sdružují s konexony sousedních buněk a tvoří propojovací kanálky (GJ) (obr. 7-8). Optimální diferenciace savčích epiteliálních buněk v komplexním prostředí vyžaduje regulované vazby GJ útvarů s dalšími proteiny (beta-katenin, klaudin, okludin, tubulin). Kromě toho musí být funkční další vazby zajišťující interakce buňka-ECM, adheze buňka-buňka a signály rozpustných faktorů (obr. 7-9 a 7-10).

Obr. 7-5 Model gap junctions

Obr. 7-6 Organizace gap junctions (GJ)
(Figure 19-15. Molecular Biology of the Cell, 4^th Edition.)

Obr. 7-7 Kompletace konexinů do „gap junctions“
(Laird D. W., Biochem J. 2006 : 527)

Obr. 7-8 Syntetické dráhy konexinů a tvorba homo- nebo hetero-buněčných GJ struktur a jejich partnerské vazebné molekuly
(El-Sabban M.E., J Mammary Gland Biol Neopl 2004 : 463)

Obr. 7-9 Proteiny vážící se s konexinem 43 (Cx43)
(Laird D. W., Biochem J 2006 : 527)

Obr. 7-10 Uspořádání spojovacích buněčných komplexů
(Laird D. W., Biochem J 2006 : 527)

Mnoho nádorů vykazuje aberantní komunikaci zprostředkovanou buněčnými kontakty, tj. ztrácí GJ komunikaci mezi sebou nebo s okolními normálními buňkami nebo vykazují abnormální expresi rozpoznávacích molekul. Snížená exprese těchto molekul je často spojena se zvýšenou metastatickou schopností nádorů. Porušená GJIC v nádorech nemusí být nutně spojena s aberantní funkcí adhezívních molekul, což předpokládá další regulační mechanizmy pro GJ. Předpokládá se, že konexinové geny fungují jako nádorově supresorové geny, kdežto geny pro adhezívní molekuly působí jako supresory metastáz.

Selektivní absence heterologní GJIC (spíše než homologní) hraje významnou úlohu v klonální expanzi nádorových buněk (obr. 7-11 a 7-12). Obnovení heterologní komunikace mezi transformovanými a normálními buňkami prokázala nádorově supresorové účinky. Pokusy s transfekcí konexinových genů ukázaly, že určité nádorové buňky jsou defektní v expresi těchto genů, ale že selektivní absence GJIC je porušována jinými mechanizmy.

Obr. 7-11 Úloha ztráty heterologního typu GJIC v karcinogenezi – Homologní komunikace

Obr. 7-12 Úloha ztráty heterologního typu GJIC v karcinogenezi – Heterologní komunikace
(Kratovskikh V. and Yamasaki H., Histol Pathol 1997 : 761)

Jak a kdy jsou během mnohastupňové karcinogeneze porušovány funkce GJ a buněčných adhezívních molekul je stále předmětem zkoumání. Existují dva základní mechanizmy:

• přímé účinky na geny;
• defekt na funkční úrovni.

To naznačuje, že jak genotoxické tak negenotoxické karcinogeny mohou indukovat takové změny, a že defekty mohou vznikat v různých stadiích karcinogeneze.

Poruchy GJIC vedoucí k deregulaci růstu a k neoplasii by mohly být integrujícím faktorem, který propojuje všechny teorie karcinogeneze dohromady. GJIC má totiž zásadní roli při udržování tkáňové homeostázy (obr. 7-13) a existuje řada důkazů na podporu její zásadní úlohy v tomto procesu.

• pro většinu nádorových buněk je charakteristická dysfunkce homo- nebo heterologní komunikace;
• většina nádorových promotorů inhibuje (reverzibilně) GJIC;
• růstové faktory a hormony mající nádorově promoční účinky inhibují GJIC;
• onkogeny jako jsou ras, raf, src mohou snižovat GJIC;
• nádorově supresorové geny zvyšují GJIC;
• transfekce nádorových buněk konexinovými geny obnovuje GJIC a růstovou regulaci těchto buněk;
• „antisense“ geny pro konexiny mohou snižovat GJIC;
• protinádorové látky a chemopreventivní agens zvyšují GJIC;
• konexinové geny fungují jako nádorově supresorové geny;
• GJIC jsou důležité pro adaptivní odpověď i apoptózu.

Obr. 7-13 „Gap junctions“ v buněčné homeostáze
(Trosko, J.E. et al., Toxicol. Lett 1998 : 71)

Řada nádorových promotorů inhibuje GJIC a indukuje buněčnou proliferaci. To vysvětluje roli těchto promotorů v klonálním růstu iniciovaných buněk ve smyslu uvolnění takových buněk z růstové kontroly okolních normálních buněk. Různé typy nádorových promotorů však mohou působit různými mechanizmy: TPA působí v době připojení konexinu k buněčné membráně, fenobarbital působí na úrovni mRNA pro konexin apod.

Snižování GJIC exogenními chemickými promotory nebo endogenními růstovými faktory nebo hormony vyžaduje překročení prahové dávky a stálé, pravidelné chronické působení. U všech známých epigeneticky a negenotoxicky působících látek existují prahové hodnoty, pod nimiž je buňka schopna obnovovat svůj původní stav bez osudových důsledků. Je jasné, že také různé typy chemikálií mají své prahové hodnoty pro modulaci GJIC a cytotoxicitu a že také různé živočišné druhy a různé typy buněk reagují na tutéž látku různě. Další důkazy o účasti blokované komunikace v nádorové promoci pocházejí ze studia účinků antipromočních látek na GJ.

Mezibuněčná komunikace je mechanizmem kontroly růstu (obr. 7-14 až 7-17). Když se buňky setkají s vnějším faktorem, k prvnímu kontaktu dochází na membráně. Účinek pak musí být přenesen do jádra různými cestami. Porušení kontaktu buněk seškrábnutím monovrstvy indukuje buněčný růst spojený s expresí genů, jako jsou c-fos. Také exprese jaderných onkogenů v-myc, v-fos může být inhibována okolními buňkami. Není však jasné jak mezibuněčný kontakt reguluje geny kontroly růstu, zda indukcí genomové instability nebo působením na určité body buněčného cyklu.

Obr. 7-14 Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ) – Růstově stimulační signál 1
Růstově stimulační signál difunduje do sousedních buněk přes GJ a dosahuje substimulační úrovně

Obr. 7-15 Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ) – Růstově stimulační signál 2
K difúzi signálu nedochází u buněk postrádajících GJ a je zahájeno buněčné dělení

Obr. 7-16 Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ) – Růstově inhibiční signál 1
Růstově stimulační signál difunduje do sousedních buněk přes GJ a zabraňuje buněčnému dělení

Obr. 7-17 Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ) – Růstově inhibiční signál 2
Signál se nešíří do buněk postrádajících GJ a dochází k buněčnému dělení

Nádorové promotory mohou indukovat genomovou nestabilitu inhibicí GJIC, např. TPA indukuje amplifikaci genů a mutace. Mnoho nádorů vykazuje defekty ve schopnosti mezibuněčné komunikace a zvýšenou genomovou nestabilitu. Je u nich rovněž zvýšená amplifikace genů. Dá se usuzovat, že v genové nestabilitě je zahrnuta transdukce signálu a protože druzí poslové v ní zahrnutí jsou distribuovány pomocí GJ, blokování GJ může ke genomové nestabilitě přispět.

GJ hrají úlohu v buněčném cyklu (exprese konexinu předchází začátku syntézy DNA). Bylo ukázáno, že mitotické buňky komunikují s klidovými buňkami pomocí GJ. Ale komunikační schopnost mitotických buněk je menší než u klidových. To znamená, že inhibice GJ může zahájit buněčný cyklus jen v úzkém rámci, asi na přechodu G1-S fáze, jak ukázaly pokusy s molekulárními probami na cykliny.

Kromě vzájemného rozpoznávání buněk a GJ zahrnuje síť mezibuněčných komunikací také humorální stimuly, jako jsou růstové faktory a hormony. Buňky komunikují jiným způsobem a v současnosti se předpokládá mechanizmus zvaný „juxtacrine communication“, kde humorální komunikace funguje jen, jsou-li heterologní buňky v kontaktu. Protože tato komunikace se účastní kontroly růstu, může hrát roli i v karcinogenezi