Genotoxicita a karcinogeneze
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.

Úloha lipidů v rozvoji nádorových onemocnění

Lipidové složky potravy ovlivňují počátek a rozvoj řady onemocnění. Vysoká hladina cholesterolu je spojena s kardiovaskulárními chorobami, které jsou nejčastější příčinou úmrtí v populaci. Lipidy produkované buňkami imunitního systému se účastní zánětlivých onemocnění, jako revmatoidní artritida, sepse, astma, zánětlivé onemocnění střeva. Změny lipidů jsou spojovány i se vznikem diabetu a hrají úlohu také v neurodegenerativních a psychických onemocněních (Alzheimerova choroba, deprese, hyperaktivita, schizofrenie apod.) S ohledem na nádorová onemocnění je uváděn zvýšený příjem tuků jako rizikový faktor zejména u nádorů tlustého střeva (kolonu), prsu či prostaty.

Důležité je však nejen množství, ale zejména složení tuků, protože tuky nejsou jen zdrojem energie, ale hrají také strukturální a regulační úlohu s významným dopadem na fyziologické funkce organizmu (obr. 15-1).

Savci syntetizují mastné kyseliny (MK) de novo z acetyl-CoA za účasti syntázy mastných kyselin (FASN). Konečným produktem je kyselina palmitová (16:0), která je elongována na kyselinu stearovou (18:0). V západní dietě je dostatečné množství těchto kyselin. Buněčné membrány však vyžadují k udržení struktury, fluidity a funkce nenasycené MK, proto existuje systém desaturace (vnášení dvojných vazeb). Elongázy prodlužují uhlíkové řetězce. Delta-9-desaturáza vnáší jednu dvojnou vazbu mezi C9-C10 a dochází ke konverzi kyseliny stearové na mononenasycenou kyselinu olejovou (18:1, n-9) (obr. 15-2).

Rostliny, na rozdíl od živočichů, jsou schopny přidávat další dvojné vazby. Delta 12-desaturáza konvertuje kyselinu olejovou na linoleovou (LA, 18:2, n-6), zatímco delta 15-desaturáza konvertuje kyselinu linoleovou na α-linolenovou (ALA, 18:3, n-3).

Vysoce nenasycené mastné kyseliny (VNMK)

(VNMK, „polyunsaturated fatty acids –PUFAs“)

VNMK jsou mastné kyseliny s 2 i více dvojnými vazbami a hrají důležitou úlohu ve struktuře membrán a v syntéze důležitých metabolitů. Živočichové nedovedou syntetizovat n-3 a n-6 VNMK de novo ani nedovedou přeměnit jednu sérii v druhou. Tyto esenciální mastné kyseliny musí být obsaženy v potravě podobně jako vitamíny. Jsou životně důležité jako složka všech membrán a permeabilní bariéry pokožky a jako prekursory metabolitů – eikosanoidů a s nimi souvisejících látek, které hrají důležitou regulační úlohu ve tkáních. Zdrojem jsou rostlinné oleje (zejména n-6 PUFA) a rybí či řasový olej (n-3 VNMK). Mnoho mořských rostlin, zvláště jednobuněčných řas též může přeměňovat ALA na kyselinu eikosapentaenovou (EPA) a dokosahexaenovou (DHA). Ty se pak dostávají potravním řetězcem do ryb a jsou obsaženy v rybím tuku.

Buněčné membrány sestávají z lipidové dvojvrstvy složené z fosfolipidů a cholesterolu a z proteinů, které jsou v této dvojvrstvě zabudovány. V inkorporaci a metabolizaci MK poskytovaných potravou jsou rozdíly mezi jednotlivými buněčnými typy a mezi inkorporací do specifických fosfolipidů (např. n-3 VNMK mají specifickou úlohu v membránách nervového systému). Poměr obsahu n-6 a n-3 VNMK ovlivňuje vlastnosti membrán, zejména jejich fluiditu a produkci látek vznikajících hydrolýzou membránových fosfolipidů.

Pro životní procesy je důležité udržování příslušných fyzikálně-chemických vlastností membrány. Tak modifikace MK v potravě mění složení fosfolipidových MK a ovlivňuje funkce zprostředkované membránovými proteiny: receptory, transportními proteiny, enzymy i funkce na membránu vázaných signálních molekul (G proteinů, fosfolipáz atd.) (obr. 15-3). VNMK jsou dále prekursory lipidových mediátorů, které hrají klíčovou úlohu v kardiovaskulárních a zánětlivých onemocněních i v procesu karcinogeneze. VNMK a jejich metabolity fungují spolu s cytokiny a hormony jako intra- i intercelulární mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě.

Existují tři hlavní skupiny VNMK n-3 (omega-3), n-6 a n-9, podle polohy dvojné vazby nejbližší ke koncovému metylovanému uhlíku.

Nomenklatura

Téměř všechny dvojné vazby jsou ve víceméně stabilní cis – konfiguraci. Všechny tři skupiny jsou metabolizovány stejným způsobem alternativními desaturačními a elongačními enzymy.

Všechny esenciální MK jsou polynenasycené, ale ne naopak. Např. n-9 VNMK nejsou esenciální – organizmus je může tvořit desaturací kyseliny olejové. Desaturační a elongační systém však preferuje n-3 a n-6 VNMK při dostatku LA a ALA v potravě. Přítomnost více než stopových množství 20:3, n-9 VNMK je indikátorem deficience esenciálních MK v potravě.

Hlavní esenciální VNMK poskytované potravou jsou cis formy LA a ALA (obr. 15-4). Jsou desaturovány a elongovány sérií reakcí, které prodlužují uhlíkový řetězec a přidávají další dvojné vazby). První krok je delta- 6-desaturace (člověk, králík a prase vykazují pomalou desaturaci, zatímco krysy a myši rychlou). Elongace je rychlá u všech druhů, ale  delta-5-desaturace se zase liší. Mezi faktory, které inhibují delta-6- desaturaci patří stárnutí, diabetes, vysoký obsah cholesterolu, vysoké uvolňování katecholaminu během stresu, nedostatek Zn, alkohol a virové infekce. Hladina LA v plazmě i hladina jejích metabolitů je snížena u alkoholiků, cystické fibrózy, infarktů myokardu atd.

LA a od ní odvozená kyselina arachidonová (AA, 20:4, n-6) je důležitým zdrojem biologicky aktivních mediátorů – eikosanoidů (prostaglandiny, leukotrieny) a v experimentálních systémech je často prokazován podpůrný účinek pro vznik a rozvoj nádorů.

Naopak u ALA a od ní odvozených EPA a DHA byly prokázány v experimentálních systémech inhibiční protinádorové účinky. DHA (22:6, n-3) je potom nejvíce nenasycenou MK s 6 dvojnými vazbami a speciálními strukturálními vlastnostmi (obr. 15-5).

Zdroji esenciálních VNMK jsou rostliny i živočichové. Lidské (ale ne kravské mléko) je poměrně bohaté na desaturační produkty LA a ALA jako jsou kyselina gamma linolenová (GLA), DGLA, AA a EPA. AA je v potravě obsažena v mase, vejcích a některé mořské potravě, ale některé metabolity nejsou běžné jinde než třeba v játrech, ledvinách, pankreatu, vaječnících, testes. V současnosti byla GLA nalezena v některých rostliných olejích (černý rybíz). Dlouhořetězcové n-3 VNMK jsou v mořské potravě (mořský plankton, řasy, tučné ryby – makrela, treska, sleď, losos) (obr. 15-6).

AA a EPA jsou prekursory eikosanoidů. Biosyntéza je katalyzována cyklooxygenázou (COX) 1 a 2 (vznik prostaglandinů a tromboxanů), 5- 12- a 15-lipoxygenázou – LOX (vznik leukotrienů a lipoxinů) a systémem monoxygenáza – cytochrom P 450 (vznik epoxykyselin a diolů). Eikosanoidy mají široké spektrum biologických aktivit a působí již ve velmi malých koncentracích. V odpověď na řadu stimulů je aktivován systém fosfolipáz, které uvolňují z fosfolipidů buněčných membrán AA, která je metabolizována na prostaglandiny (PG), tromboxany (TX, způsobují agregaci destiček a vasokonstrikci) a prostacyklin PGI₂ enzymem COX 1 a 2 a prostřednictvím LOX na řadu typů hydroperoxykyselin (HPETE) a leukotrieny (LT). EPA může být metabolizována na PGI₃, který je aktivní jako vasodilatační a antiagregační a v malém množství TXA3, který je inaktivní a LT typu 5. Dalšími metabolity jsou pak resolviny a neuroprotektiny vznikající rovněž z DHA (obr. 15-7).

V průběhu vývoje lidské společnosti od lovců sběračů přes zemědělskou k industriální společnosti se také zásadně změnila spotřeba a spektrum lipidů ve výživě. Během průmyslové revoluce došlo zejména k prudkému nárůstu spotřeby celkového tuku a nasycených MK se současným poklesem příjmu antioxidantů ve formě vit C a E a rovněž se rozevřely nůžky mezi spotřebou n-6 a n-3 VNMK v neprospěch n-3 (obr. 15-8). Poměr n-6:n-3 VNMK v dietě drasticky změnil a uvádí se, že v tzv. západní dietě (Western diet) je dnes místo 1:1 poměr změněn na 10–25:1. V potravinách se také objevily trans mastné kyseliny vznikající průmyslovým zpracováním tuků, které mohou mít negativní dopady na lidské zdraví. Zatímco proteiny jsou geneticky determinovány, složení buněčné membrány s ohledem na VNMK je z velké části závislé na příjmu z potravy. Kanada se stala první zemí s dietetickými doporučeními množství n-3 a n-6 VNMK pro různé věkové skupiny a těhotné ženy.

VNMK typu n-3 a n-6 jsou metabolicky i funkčně odlišné, ale soutěží o stejné desaturační a elongační enzymy. Důsledkem dodání n-3 VNMK je tak inhibice syntézy AA z LA a snížení produkce aktivních eikosanoidů. Jejich rovnováha je důležitá pro homeostázu a normální vývoj. Nepoměr n-3 a n-6 VNMK pak přispívá mj. i k rozvoji zánětlivých a nádorových onemocnění. (obr. 15-9)

Nenasycené mastné kyseliny v karcinogenezi

Epidemiologické, klinické a laboratorní studie poukazují na důležitost množství a druhu konzumovaných tuků v etiologii a přežívání některých druhů nádorů (zvláště prsu, kolonu). Zatímco nasycené mastné kyseliny mohou stimulovat iniciaci karcinogeneze, nenasycené mastné kyseliny mohou působit v promoční a progresívní fázi v dávkové závislosti. Epidemiologické studie předpokládají, že nízkotuková dieta v kombinaci s nenasycenými MK, kde je vyvážený poměr  n-3:n-6 souvisí s nižší mortalitou nádoru prsu a kolonu. Úloha těchto VNMK je zkoumána rovněž u dalších typů nádorů gastrointestinálního traktu (např. pankreatu) i u nádorů prostaty. Některé tuky, zvláště s obsahem mononenasycených nebo n-3 VNMK nemají promoční účinky, i když jejich obsah v potravě je vysoký.

Během posledních 10–15 let se objevilo několik tisíc studií na tkáňových kulturách, živočišných modelech i klinické studie, které sledují úlohu n-3 VNMK (EPA, DHA) z hlediska jejich antitrombických, hypolipidemických, antihypertensních a protizánětlivých účinků. Průlomové byly práce Kang a spol. z Bostonu v Massachusetts, kteří objevili Fat-1 gen (C. elegans) kódující omega 3 desaturázu, kterou savci postrádají a prokázali celou škálu prospěšných účinků n-3 VNMK na modelech transgenních buněk, myší, prasat apod. Byly prokázány antiarytmické, protizánětlivé, antialergické, neuroregenerativní i protinádorové účinky. Přesné mechanizmy účinků různých lipidů a VNMK nejsou však stále objasněny.

Hlavní uvažované mechanizmy působení VNMK, které se mohou uplatňovat v průběhu karcinogeneze

• strukturální a funkční změny membrán, jejichž nedílnou součástí VNMK jsou. Ovlivnění biofyzikálních i biochemických vlastností membrán má dopad zejména na funkce na membránu vázaných proteinů, přenašečů a receptorů;

• produkce specifických metabolitů ovlivňujících buněčné signálování a genovou expresi, např. eikosanoidy, ceramid, DAG atd. i imunitní systém a uplatňujících se v zánětu;

• produkce množství ROS, NOS a lipidové peroxidy vznikající metabolizací VNMK a ovlivňující řadu dějů v buňkách a tkáních. VNMK ovlivňují i antioxidační systémy a dochází ke změnám redoxní rovnováhy;

• přímé působení na vnitrobuněčné signální složky jako jsou, specifické signální molekuly (kinázy, fosfatázy) a transkripční faktory. V důsledku toho dochází pak ke změnám přenosu signálů a exprese genů s dopady na chování buněk.

Účinky tuků mohou být přímé (zahrnují změny ve struktuře a funkci buněčných membrán) nebo nepřímé (zahrnují změny v endokrinním systému a metabolizmu VNMK, tj. syntéza PG a LT a dále suprese imunitní odpovědi). Některé VNMK mohou účinně a přímo řídit transkripci specifických genů (např. geny kódující lipogenní proteiny, delta desaturázy atd.).

Tak může příznivý a nepříznivý účinek lipidů na různé choroby zahrnovat kombinaci interaktivních regulačních mechanizmů:

1. akutní, rychlá a přímá regulace exprese genů;

2. dlouhodobá adaptivní modulace složení membrán, která může přímo ovlivnit příjem a přenos signálů hormonů, cytokinů, produkci eikosanoidů apod.

Výsledky na zvířecích modelech s nádory indukovanými karcinogeny nebo transplantovanými nádory ukazují, že n-3 VNMK mohou snižovat výskyt nádorů, jejich velikost i rychlost růstu. Naopak u n-6 VNMK byl mnohdy prokázán podpůrný účinek na tvorbu a vývoj nádorů. N-3 VNMK v dietě snižují tvorbu PGE₂ a zabraňují nebo zpožďují tvorbu transplantovaných nádorů u laboratorních zvířat. Ve studiích s buňkami lidského nádoru prsu na nahých myších měly myši krmené tukovou dietou obsahující n-3 VNMK méně plicních metastáz, snížený obsah estrogenu a prolaktinu v séru, méně PGE₂ v nádoru a redukovanou hladinu mRNA pro c-myc onkogen v buňkách nádorové tkáně.

Živočišné studie v současné době využívají podávání rybího oleje k odhalení mechanizmů včetně změn v produkci PGE₂, imunitní funkce, tvorby volných radikálů, změn ve fluiditě membrán, modulace vnitrobuněčného transportního systému, hormonální sekrece, využití kalorií i genové exprese. Nádorově podpůrné působení některých tuků může také souviset s jejich schopností snižovat nebo inhibovat mezibuněčnou komunikaci a blokovat tak metabolickou kooperaci. Ztráta zpětnovazebné kontroly pak přispívá k nádorovému bujení (obr. 15-11).

Řada výzkumných týmů je zaměřena na výzkum mechanizmů účinků VNMK u nádorových buněk in vitro v tkáňových kulturách. Bylo zjištěno, že tyto látky působí cytostaticky a cytotoxicky na řadu nádorových línií, ale ve stejných koncentracích tak většinou nepůsobí na nenádorové ekvivalenty těchto buněk. Nejúčinnější jsou VNMK se 3 a 4 dvojnými vazbami (AA, gamma linoleová, LA). VNMK s 2 a 6 vazbami jsou inaktivní a EPA s 5 je středně aktivní. Rybí olej obsahující EPA a DHA je též účinný. Významné protinádorové působení bylo ale potvrzeno rovněž u konjugované kyseliny linoleové (cLA, n-6).

Současné údaje prokazují vedoucí úlohu lipidů v kontrole peroxidativního poškození membrán. Dvojné nenasycené vazby podléhají autokatalytickému procesu, který produkuje celou řadu produktů. Peroxidace lipidů hraje důležitou regulační roli v mitotické aktivitě buňky protřednictvím produktů degradace membránových lipidů. Tento mechanizmus je v nádorových buňkách defektní, stupeň peroxidace je nízký a metabolizmus reaktivních druhů kyslíku je aberantní.

Při maligní transformaci dochází kromě jiných změn též k restrikci exprese antioxidativní enzymatické ochrany buňky. Oxidativní stres pak poškozuje lipidové struktury membrány a snižuje obsah VNMK.

V růstové fázi nádoru je jeden z kontrolních mechanizmů buněčného dělení, inhibiční působení produktů peroxidace lipidů na syntézu DNA, značně snížen. Membrány nádorových buněk jsou změněny co do složení a strukturální organizace lipidů v raném stadiu neoplastické transformace mimo jiné v důsledku snížení antioxidační ochrany.

Nádorové buňky jsou pak rezistentní k peroxidaci lipidů díky:

1. nízkému obsahu VNMK;

2. snížení koncentrace cytochromu P-450;

3. sníženému obsahu NADPH;

4. zvýšené antioxidační aktivitě (opak než při transformaci).

Metabolizmus a obrat fosfolipidů v membránách i oxidativní metabolizmus nádorových buněk se zásadně liší od buněk nenádorových.

Např. nádorové buňky kolonu vykazují:

• změny ve spektru a koncentraci VNMK ve srovnání s normální tkání;
• zvýšenou periferní utilizaci VNMK z potravy, změny v oxidativním metabolizmu a antioxidační ochraně;
• zvýšenou aktivitu enzymů metabolizmu AA (COX-2, 12-LOX) a produkci eikosanoidů;
• sníženou citlivost k endogenním inhibitorům růstu (TGF-β1), induktorům apoptózy (TNFα, FasL, TRAIL) a diferenciace (butyrát).

Některé zdroje uvádějí, že stupeň tumorigenicity nepřímo úměrně koreluje s obsahem VNMK v membránách buněk. VNMK zabíjející nádorové buňky v kultuře mohou iniciovat vlastní peroxidaci zvýšeným počtem superoxidových radikálů. Normální buňky tak nereagují, což skýtá možnosti selektivního ovlivňování nádorových buněk.

V experimentálních systémech in vivo byly prokázány změny spektra MK v plazmě i tkáních po podávání n-6 nebo n-3 VNMK (obr. 15-12). V plazmě nádorových pacientů a v nádorové tkáni a buňkách byly ve srovnání s nenádorovými buňkami prokázány změny ve složení a metabolizmu lipidů. Jedná se zejména o snížení obsahu n-3 VNMK (DHA) ve srovnání s n-6 (LA a AA). Ukázalo se, že dlouhodobější podávání vysokých dávek EPA a DHA zvyšuje jejich obsah v plazmě, v membránách erytrocytů, ale i v membránách buněk jiných tkání vč. nádorových.

Integrovaný pohled na komplexní lipidové interakce, které určují výsledný tzv. lipidom tvoří lipidový profil jednotlivce, který může být důležitý s ohledem na riziko vzniku některých typů nádorových onemocnění ovlivňovaných dietou. S protekcí určitých typů nádorů (např. prsu) je spojen složený indikátor kombinující zvýšené mononenasycené MK a nízký poměr n-6/n-3 PUFAs. Tento lipidom by se mohl stát templátem pro detekci rizika nádorů prsu ve vztahu k dietě (obr. 15-13).

Během karcinogeneze se vyvíjí tzv. lipogenní charakter buněk. Znamená to zvýšenou endogenní syntézu mastných kyselin a sníženou citlivost k nutričním zásahům. Syntáza mastných kyselin (FASN – fatty acid synthase) funguje pod transkripční kontrolou tzv. SREBP1c (sterol regulatory element-binding protein), jehož aktivita může bát ovlivňována hormonálně a nutričně a je napojena částečně na signálovou transdukci přes fosfoinositol-3 kinázu (PI3K)/Akt a ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase) regulující expresi a maturaci SREBP (obr. 15-14a, 15-14b).

U nádorových buněk hyperaktivace této dráhy v důsledku onkogenní deregulace (nadprodukce růst. faktorů, hyperaktivace receptorů, nebo ztráta funkce negativních regulátorů, např. PTEN) způsobí konstitutivní expresi či maturaci SREBP1c, zvýšenou transkripci a aktivitu FASN a v důsledku toho zvýšenou syntézu lipidů, které jsou vyžadovány pro energii i stavbu buněčných membrán při rychlém dělení nádorových buněk (obr. 15-15).

U nádorů prsu byla např. detekována zvýšená exprese a aktivace receptoru Her-2/neu (receptor pro EGF) a aktivace signálních drah PI3K/Akt a MAPK (mitogen activated protein kinase). Aktivita tohoto receptoru může být také ovlivňována složením lipidových raftů. Během maligní transformace se tak zvyšuje exprese a aktivita FASN. Tyto procesy mohou být ovlivněny, hormony či dietetickými faktory (obr. 15-16).

Metabolizmus VNMK, tvorba eikosanoidů

VNMK mohou v buňkách fungovat přímo nebo jsou metabolizovány na velkou škálu více či méně stabilních oxidačních produktů. V důsledku různých podnětů jsou také vázané VNMK (AA, EPA, DHA) uvolňovány z sn-2 pozice  membránových fosfolipidů a to enzymy fosfolipázami a přeměna na eikosanoidy je katylyzována cyklooxygenázami (izoenzymy COX-1 a COX-2), lipoxygenázami (nejběžnější 5-, 12- a 15-LOX) a cytochromy P-450.

Fosfolipáza A2 je enzym účastnící se lipidového metabolizmu, důležitý pro řadu buněčných procesů. Rozlišují se tři skupiny:

• sekretovaná PLA2 (sPLA2),
• na vápníku nezávislá PLA2 (iPLA2),
• na vápníku závislá cytosolová PLA2 (cPLA2).

Kromě úlohy v buněčném signálování souvisejí PLA2 s různými patologickými stavy, včetně zánětu, tkáňové reparace a nádorů. U řady nádorů byly detekovány zvýšené hladiny sPLA2 a cPLA2, takže jsou tyto molekuly také cílem protinádorové terapie.

sPLA2 se uplatňuje v zánětlivé odpovědi. Prozánětlivé cytokiny indukují její expresi, aktivační faktory uvolňují sPLA2 ze sekrečních granul do extracelulární matrix. Za přítomnosti Ca2+ hydrolyzuje sPLA2membránové fosfolipidy sousedních buněk. Uvolnění AA a následná tvorba eikosanoidů pak indukuje zánět (obr. 15-17).

Prozánětlivé cytokiny indukují také expresi cPLA2. Následuje fosforylace zprostředkovaná MAP kinázami. Ca2+ způsobuje translokaci cPLA2 z cytosolu do perinukleární membrány, kde je také její substrát a enzymy nutné k tvorbě eikosanoidů. Aktivovaná cPLA2 lyzuje membránové fosfolipidy a uvolňuje AA, která je metabolizována COX a LOX (obr. 15-18).

Je předpokládán model konstitutivní zvýšené exprese cPLA2 a COX-2 u nádorových buněk (obr. 15-19). Zatímco COX-1 je exprimována konstitutivně a zajišťuje tkáňovou homeostázu, COX-2 je inducibilní a exprimuje se v případě zánětu. Její nadměrná exprese byla také detekována ve vysokém procentu (až 80 %) u řady nádorů. Prozánětlivé cytokiny, růstové faktory i nádorové promotory aktivují signální dráhy vedoucí k transkripci genů pro cPLA2 a COX-2 (obr. 15-20). Ty podporují uvolňování AA a její přeměnu na prozánětlivé, imunosupresívní a proliferaci podporující prostaglandiny. Např. PGE₂ podporuje růst nádorů aktivací specifických receptorů EP a následných signálů vedoucích ke stimulaci buněčné proliferace, inhibici apoptózy, podpoře angiogeneze, stimulace invaze, motility a tvorby metastáz a supresi imunitní odpovědi (obr. 15-21). COX-2 je indukována řadou podnětů (onkogeny, růstové faktory, nádorové promotory). Stimulace PKC nebo signálování přes Ras zvyšují aktivitu MAPK, což vyúsťuje ve zvýšenou transkripci COX-2 zprostředkovanou řadou transkripčních faktorů (AP1, NFκB). COX-2 může být také regulována posttranskripčními mechanizmy (obr. 15-22).

O vývoji nádorů rozhoduje rovněž rovnováha v produkci různých isoforem LOX (pro- i protinádorově působících) a jejich biologická aktivita (obr. 15-23). 12- a 15-LOX a jejich metabolity podporují průchod nádorových buněk buněčným cyklem. Jejich inhibice způsobuje zástavu buněčného cyklu následovanou obvykle apoptózou (obr. 15-24). 12(S)-HETE se váže na receptory spojené s G-proteiny. Aktivace receptoru spouští vnitrobuněčné signální dráhy, např. ERK, PI3K/Akt, IP3/DAG zprostředkující funkční odpověď zahrnutou v progresi nádoru (obr. 15-25).

Eikosanoidy obecně působí na buňky prostřednictvím řady specifických transmembránových receptorů spřažených s G proteiny a aktivací příslušných signálních drah (obr. 15-26).

Úlohu metabolizmu VNMK v nádorovém onemocnění podporují nálezy změn tohoto metabolizmu a produkce zvýšeného množství metabolitů AA u řady nádorů. Úroveň exprese jednotlivých typů enzymů se liší podle typu a histologického stupně nádoru. Mitogenní a viabilitní faktory (EGF, HGF atd.) a prozánětlivé cytokiny (TNF-α, IL-1) indukují uvolňování AA a tvorbu eikosanoidů, které slouží jako přenašeče nebo modulátory signálů regulujících proliferaci a apoptózu. Podporují pak progresi nádoru indukcí proliferace, přežívání, migrace a invaze nádorových epiteliálních buněk (obr. 15-27).

Interakce s buňkami imunitního systému

Mnoho studií ukázalo, že množství a typ tuků v dietě může ovlivňovat funkce buněk imunitního systému. Patří k nim proliferace lymfocytů v odpověď na mitogenní signály, cytotoxická aktivita T-lymfocytů, NK buněk nebo makrofágů, chemotaxe neutrofilů a monocytů a exprese hlavního histokompatibilního systému a přítomnost antigenů.

VNMK (n-3 a n-6) mohou ovlivňovat komunikaci buněk imunitního systému, která se uskutečňuje buď prostřednictvím chemických mediátorů (eikosanoidy, cytokiny, NO atd.) nebo přímo kontaktem mezi buňkami prostřednictvím adhezívních molekul. Existuje vzájemná stimulace produkce a působení prozánětlivých cytokinů a eikosanoidů. PG a LT odvozené od AA a cytokiny jsou produkovány nádorovými buňkami, stromálními buňkami, endoteliálními buňkami i buňkami imunitního systému a mohou působit autokrinně a parakrinně (obr. 15-28). To pak vyúsťuje v podporu přežití, proliferace, migraci, invazi, angiogenezi a imunosupresi (obr. 15-29).

Účinky nesteroidních protizánětlivých látek

(non-steroidal antiinflammatory drugs – NSAIDs)

Existuje řada přírodních a syntetických látek, které mají schopnost inhibovat aktivitu enzymů metabolizujících VNMK. Nesteroidní antiflogistika patří mezi farmaka běžně používaná v klinice k léčbě bolesti a zánětu (aspirin, sulindac, indometacin, ibuprofen, piroxicam). Inhibují aktivitu COX, produkci PGE₂ a mohou mít preventivní a terapeutické účinky na rozvoj nádorů, zejména kolonu. Důležitý byl objev selektivních inhibitorů COX-2 (tzv. coxibů), které jsou účinnější a nemají takové nepříznivé vedlejší účinky jako látky, které inhibují oba izoenzymy. Dlouhodobé užívání těchto látek však může mít negativní účinky, např. na žaludeční a střevní sliznici či srdeční činnost.

Bylo prokázáno, že NSAID mohou snižovat proliferaci a indukovat apoptózu, avšak mechanizmy mohou být závislými i nezásvislé na aktivitě COX. Účinky těchto látek mohou být přímé (ovlivnění signálních drah, receptorů či transkripčních faktorů, přes které působí aktivátory COX a metabolity AA) nebo nepřímé zprotředkované např. změnami aktivity imunitního systému (liší se účinky v systémech in vitro a in vivo).

Rovněž u řady inhibitorů LOX (NDGA, esculetin, MK-886) byla prokázána schopnost snižovat proliferaci a indukovat apoptózu řady nádorových línií. Prokázalo se, že produkty 5-LOX fungují jako druzí poslové řady růstových a viabilitních faktorů. Produkty 12-LOX se zase uplatňují v procesu invaze a tvorby metastáz tím, že ovlivňují exprese proteáz či adhezívních molekul.

Molekulární mechanizmy působení n-3 VNMK

Vzhledem k prokazovanému protinádorovému působení n-3 VNMK je velké úsilí věnováno výzkumu molekulárních mechanizmů účinků. Jsou uvažovány zejména:

• změny vlastností buněčných membrán (fluidita, lipidové rafty) a s tím související změny v signálování některých faktorů;
• suprese biosyntézy eikosanoidů odvozených od AA ovlivňující imunitní odpověď a modulující zánět, proliferaci, apoptózu i tvorbu metastáz a angiogenezi;
• ovlivnění signálové transdukce, tj. aktivity specifických signálních drah (PI3K/Akt, ERK, p38), transkripčních faktorů (NFκB, PPARγ, SREBP) a genové exprese působící změny metabolizmu, buněčného růstu, diferenciace a apoptózy;
• změny metabolizmu estrogenů a redukce estrogeny stimulovaného růstu;
• zvýšená nebo snížená produkce volných radikálů (kyslíku i dusíku);
• mechanizmy zahrnující citlivost k insulinu.

Změny biofyzikálních vlastností buněčných membrán provázejí procesy diferenciace a apoptózy savčích buněk a souvisejí do značné míry s modulacemi ve složení, struktuře, symetrii a metabolizmu buněčných lipidů. Byly pozorovány rozdíly těchto vlastností u nádorových a normálních buněk i u nádorových buněk senzitivních a rezistentních k cytostatikám.

Lipidové membránové mikrodomény

V posledních letech je věnována velká pozornost speciálním oblastem buněčné membrány, tzv. lipidovým membránovým mikrodoménám – raftům a kaveolám.

Ty představují malé oblasti proteinů a lipidů v membráně s unikátním složením lipidů, bohaté na cholesterol a sfingolipidy. Tyto struktury jsou funkčně zahrnuty v kompartmentalizaci, modulaci a integraci buněčných signálů a tak modulují důležité procesy jako buněčný růst či apoptózu. Dvojvrstva lipidů v raftu je asymetrická, kde vnější vrstva („exoplasmatic leaflet“) je obohacená sfingomyeliny a glykosfingolipidy a vnitřní vrstva („cytoplasmic leaflet“) obsahuje glycerolipidy. Rafty obsahují proteiny upevněné k dvojvrstvě acylovým koncem GPI kotvami (např. kináza Yes z rodiny Src) nebo přes transmembránové domény (virové proteiny neuraminidáza a hemaglutinin – HA) (obr 15-31).

Sfingolipidy se liší od ostatních fosfolipidů svými dlouhými většinou nasycenými acylovými řetězci, které jim dovolují být pevně sbaleny v dvojvrstvě a tvořit gelovou fázi, ve které je velmi malá možnost laterálního pohybu nebo difúze Tato gelová fáze je měněna připojením cholesterolu, který kondenzuje uspořádání sfingolipidů obsazením prostoru mezi acylovými řetězci (obr. 15-32). Tak sfingolipidové mikrodomény obsahující cholesterol existují v podobě tekuté fáze („liquid-ordered“), významně fluidnější než fáze gelová. Na druhé straně, fosfolipidy jsou bohaté na nenasycené acylové řetězce, které jsou volněji sbaleny, výrazně fluidnější („liquid disordered“) a umožňují tak rychlý laterální pohyb uvnitř dvojvrstvy. Tyto rozdíly pak pravděpodobně vedou k fázové separaci mezi sfingolipidy a fosfolipidy. Sfingolipidové mikrodomény plavou ve fosfolipidové dvojvrstvě (lipidové rafty). Cholesterol upřednostňuje „liquid ordered“ fázi a je zásadní pro udržení obou fází. Vnější vrstva membránových raftů je spojena s vnitřní vrstvou bohatou na fosfolipidy a cholesterol. Velikost raftů a jejich doba přetrvávání není zcela jasná. Uvádí se elementární velikost 26–70 nm obsahující jen několik tisíc molekul vážících několik málo proteinů. Rafty selektivně zahrnují nebo naopak vylučují některé proteiny a slouží tak jako mechanizmus pro laterální dělení proteinů v membráně. Umístění či vyloučení určitých proteinů (např. receptorů, přenašečů) ovlivňuje pak jejich aktivaci. VNMK jsou základní složkou lipidových raftů a předpokládá se, že např. DHA může částečně působit zvýšením fázové separace lipidů v membráně.

Kaveoly jsou tvořeny proteiny kaveoliny tvořícími vlasové smyčky v membráně. Kaveolin je 21–24 kDa membránový protein. Funguje jako složka membránových systémů zprostředkovávajících molekulární transport, buněčnou adhezi nebo signální transdukci. Zajišťuje např. transport proteinů z endoplazmatického retikula (ER) k membráně a může regulovat aktivitu řady regulačních a signálních molekul, např. ERK, Ras, Raf, PI3K/Akt, TGFβ, Wnt/beta katenin, COX-2, cyklin D1. U řady nádorů byly detekovány časté změny kaveolinu-1 a to buď snížená exprese (nádory vaječníků, plic a prsu) či zvýšená exprese (nádory prostaty, žlučníku či kolonu). V některých případech působí jako supresor růstu nádoru, ale přes různé mechanizmy může přispívat i k vývoji maligních struktur. PPARγ je regulátorem exprese kaveolinu v lidských nádorových buňkách.

Buněčný příjem, transport a akumulace MK

Strukturální integrita raftů a kaveol je základní také pro příjem VNMK. MK jsou obecně vázány na albumin v séru a přenášeny přes membránu difúzí nebo pomocí specifických transportních proteinů (FATPs). Byla objevena řada proteinů zodpovědných za aktivní přenos mastných kyselin – FATP 1–6 (fatty acid transport proteins). Jsou to acyl CoA ligázy, které zrychlují příjem MK jejich přeměnou na acyl CoA. Vykazují různou tkáňovou distribuci: FATP1 v tukové tkáni, FATP4 ve střevě, FATP2 a 5 v játrech (obr. 15-33).

FAT/CD36 (88 kDa) je lipoproteinový receptor v plazmatické (a pravděpodobně i mitochondriální) membráně a je vázána v lipidových raftech. Spolu s FABPpm (plasma membrane-associated fatty acid-binding protein (43 kDa) vážou MK na povrchu, zvyšují lokální koncentraci a usnadňují tak difúzi. CD36 je zároveň multifunkční adhezní receptor pro trombospodin a kolagen a „scavenger“ receptor pro LDL (low density lipoprotein) exprimovaný na plateletech, monocytech ale i jiných typech buněk. Je exprimován i enterocyty, myocyty či endoteliálními buňkami. Exprese FAT/CD36 je ovlivňována mj. transkripčním faktorem PPARγ. Zpětně FAT/CD36 kontroluje např. diferenciaci adipocytů regulací hladiny aktivátorů PPARγ.

Uvnitř buněk zajišťují přesun MK specifické vazebné proteiny FABP 1–17 (fatty acid binding proteins) před vstupem do metabolických či signálních drah. Malá část MK je transportována FABP a rychle aktivována membránovými acyl-CoA syntázami (ACS1) a tvoří estery acyl-CoA. MK s dlouhým řetězcem (> C22) jsou transportovány preferenčně a přímo konvertovány na estery acyl-CoA s velmi dlouhým řetězcem.

Po dodání mastných kyselin a jejich vstupu do buňky se v cytoplazmě tvoří útvary zvané lipidové droplety (LD) nebo tělíska (bodies). Jsou syntetizována v ER, kde se tvoří a odlučují. LD tvořící nezávislé organely ohraničené monovrstvou fosfolipidů a napojených specifických proteinů (rodina PAT proteinů). Uvnitř jsou zejména triacylglyceroly, které slouží jako zásobárna energie a zdroj signálních molekul (obr. 15-35).

LD hrají významnou úlohu i v udržování lipidové homostázy, metabolizmu lipidů a přenosu vnitrobuněčných signálů. Je s nimi spojena činnost řady enzymů lipidového metabolizmu, ale rovněž dalších signálních molekul nebo cytokinů (obr. 15-36).

V netukové tkáni způsobuje vysoké množství MK prostřednictvím lipidových metabolitů a signálních drah oxidativní stres a stres ER. Lipotoxicita způsobuje dysfunkci mitochondrií a ER, což je klíčový mechanizmus jak nadbytek lipidů indukuje buněčnou smrt. Nasměrování lipidů a jejich uchování v lipidových dropletech působí cytoprotektivně (obr. 15-37).

Děje na mitochondriích a oxidativní metabolizmus

Zvýšené množství VNMK vede ke zvýšené produkci ROS a lipidové peroxidaci, což vyvolává oxidativní stres. Kromě ROS hrají v rozvoji nádorů úlohu i reaktivní metabolity dusíku (RNS), jejichž produkce je stimulována aktivací inducibilní syntázy oxidů dusíku iNOS. Oxidativní produkty (aldehydy, hydroxynonenal) mohou přímo oxidativně poškozovat DNA a působit mutace a genetickou nestabilitu, mohou také aktivovat specifické transkripční faktory a měnit expresi genů (aktivovat onkogeny), ovlivňovat mitochondrie a aktivitu apoptických proteinů s nimi spojených. Mohou také poškozovat lipidy (lipidová peroxidace) či proteiny, což se může účastnit různými mechanizmy angiogeneze a tvorby metastáz. Změněná redoxní rovnováha může také podporovat rezistenci k chemoterapii (obr. 15-38). Na druhé straně může oxidativní poškození likvidovat selektivně nádorové buňky na základě jejich odlišného oxidativního metabolizmu a snížené antioxidační ochrany.

Ze souhrnu řady studií se ukázalo, že MK působí v závislosti na koncentraci. Nízké koncentrace mohou podporovat buněčný růst, kdežto vysoké koncentrace, díky zejména indukci oxidativního metabolizmu, mohou růst tlumit a indukovat buněčnou smrt. Zvýšená produkce PG, ale podporuje proliferaci různými parakrinními i autokrinními mechanizmy (podpora produkce cytokinů, ovlivnění vnitrobuněčných signálních drah, imunosuprese) (obr. 15-39).

VNMK, zejména n-3 DHA fyzicky interagují s mitochondriální membránou, mění její permeabilitu otevíráním MTP (membrane permeability pores) a snižují tak membránový potenciál. DHA je přednostně inkorporována do kardiolipinu, fosfolipidu vnitřní mitochondriální membrány. Zvýšená polynenasycenost membránové dvojvrstvy (zejména následkem obsahu DHA) mění fyzikální vlastnosti, zvyšuje molekulární aktivitu membránových proteinů a metabolickou aktivitu buněk, tkání a celého organizmu.

Kardiolipin (difosfatidyl glycerol, glycerolfosfolipid) tvoří hlavní součást membrán mitochondrií. DHA se přednostně vestavuje do sn-2 pozice kardiolipinu, mění nenasycenost mitochondriální membrány a oxidativní metabolizmus (obr. 15-40). To souvisí s aktivitou cytochrom c oxidázy vázané na  kardiolipin, s uvolňováním cytochromu c a apoptózou. S lipidy mitochondriální membrány reagují rovněž proteiny rodiny Bcl-2 (pro- i antiapoptické) a tak mohou VNMK modulovat jejich aktivitu (obr. 15-41).

Další mechanizmy působení n-3 VNMK

Jeden z mechanizmů protinádorového působení n-3 VNMK zahrnuje také inhibici metabolizmu AA kompeticí o metabolizující enzymy. Jsou pak produkovány méně biologicky aktivní a protizánětlivé produkty odvozené od EPA (PG typu 3 a LT typu 5, resolviny E) nebo DHA (resolviny D a neuroprotektiny) (obr. 15-42). Tímto způsobem mohou n-3 VNMK ovlivnit i produkci a funkci různých cytokinů (zejména prozánětlivých). Studie na laboratorních zvířatech i u lidí ukazují, že n-3 VNMK mohou ovlivnit (zvýšit nebo snížit) produkce cytokinů jako je TNFα, IL-1, IL-6 u makrofágů (existují rozdíly mezi aktivovanými a rezidentními). U lidí byla po působení n-3 VNMK prokázána snížená produkce těchto cytokinů. Toto protizánětlivé a imunitní systém podporující působení může hrát úlohu i v karcinogenezi, jmenovitě u nádorů kolonu, prostaty či pankreatu.

V poslední době bylo prokázáno, že VNMK typu n-3 a n-6 mohou odlišně ovlivňovat nejen vlastnosti buněčných membrán a přenos signálů do buněk, ale rovněž dráhy přenosu signálů, které spojují povrchové receptory s aktivací transkripčních faktorů (hydrolýza membránových fosfolipidů a vznik druhých poslů – DAG, ceramidy, aktivace PKC, změny intacelulárního Ca2+) nebo přímou vazbou na vnitrobuněčné receptory – transkripční faktory a změnou jejich aktivace, např. NFκB, AP-1, myc, fos, jun nebo receptory pro steroidní hormony. Tak mohou VNMK nebo jejich metabolity ovlivňovat expresi genů a regulaci důležitých buněčných procesů (obr. 15-43).

NFκB je transkripční faktor, který reguluje syntézu cytokinů jako je TNF, Il-1, IL-2, IL-6 a INFβ. Mastné kyseliny a jejich produkty rovněž aktivují jaderné receptory pro peroxizómové proliferátory (PPARα, β/δ, γ), které působí jako transkripční faktory, účastní se regulace lipidového metabolizmu a mohou ovlivňovat proliferaci, diferenciaci a apoptózu různých typů buněk. N-3 VNMK aktivují PPARγ, který inhibuje signální dráhu NFκB a mohou inhibovat toll-like receptor 4 (TLR4). Tyto regulační dráhy snižují produkci prozánětlivých cytokinů a expresi adhezívních molekul, což vede např. ke snížení zánětu střeva. (obr. 15-44)

Aktivátory PPAR jsou AA, LA a jejich deriváty, např. LTB4 nebo 8S-HETE, které aktivují PPARα,15-deoxy PGJ2 a 15-HETE aktivující PPARγ nebo PGI2 (prostacyklin) aktivující PPARβ/δ. PPAR fungují jako heterodimery s RXR a dalšími koaktivátory a korepresory a vážou se na specifický responsivní element DNA přítomný v promotorové oblasti řady genů, které jsou takto transkripčně aktivovány. (obr. 15-45)

Dalšími transkripčními faktory ovlivňovanými VNMK jsou např. SREBP (sterol regulatory-binding proteins) nebo i estrogenní receptor.

Praktické aspekty – klinika

Z výše uvedených poznatků vyplývá, že existují vzájemné vztahy mezi výživou (jejími lipidovými složkami), infekčními a zánětlivými chorobami zprostředkovanými cytokiny i rozvojem některých nádorových onemocnění (obr. 15-46).

U pacientů s nádory se vyvíjejí specifické klinické symptomy, které mohou být ovlivňovány výživou. (obr. 15-47)

Z poznatků získaných z epidemiologických, experimentálních i cílených klinických studií o úloze a mechanizmech působení VNMK při vzniku a rozvoji různých onemocnění včetně nádorových vycházejí pak dietetická doporučení směřující zejména k uchování zdraví a prevenci onemocnění, ale také k využití těchto látek v terapii.

Prevence

Terapie

Epidemiologické studie snížená incidence nádorů (kolonu) v populacích konzumujících velké množství ω-3 VNMK z mořské stravy. Experimentální studie ω-3 VNMK inhibují karcinogeny-indukovanou karcinogenezi; redukují růst transplantovaných nádorů u laboratorních zvířat; snižují proliferaci a indukují apoptózu u nádorových buněk kolonu in vitro. Klinické studie EPA a DHA inhibují proliferaci epiteliálních buněk kolonu u pacientů s adenomy a vysokým rizikem nádorového onemocnění.

Při chirurgických zákrocích předoperační perorální nebo pooperační enterální či parenterální dieta s ω-3 VNMK zlepšuje postoperační zánětlivou a imunitní odpověď a snižuje infekci. Dieta s ω-3 VNMK zlepšuje nádorovou kachexii a kvalitu života. Kombinace se standartní terapií (chemoterapie, záření) dieta s ω-3 VNMK netoxický způsob zvýšení účinků terapie; samotné použití ω-3 VNMK užitečný přístup, jestliže je vyloučena toxická standartní terapie.

U terapeutického využití mluvíme o tzv. nutriční farmakologii, která využívá tyto látky buď přímo jako terapeutika nebo zejména k podpůrné terapii s ostatními léky nebo jako nosiče léků. Cílená výživa při určitém onemocnění může různým způsobem podpořit boj organizmu s touto nemocí („disease specific nutrition“).

Složení a využití lipidových emulzí

Obecně jsou VNMK obsaženy v lipidových emulzích, které jsou součástí parenterální a enterální výživy i nádorových pacientů (pooperační stavy, podvýživa atd.). Tyto emulze většinou představují směsi přírodních olejů (většinou sojový, kokosový), emulgované fosfolipidy (vaječný lecitin, sojové fosfolipidy) a izotonizační přísadu (glycerol). Vytvářejí se tukové částice podobné chilomikronům (obr. 15-48).

V parenterální výživě jsou aplikovány nitrožilně jako součást tzv. „all-in-one“ vaků a slouží zejména jako zdroj energie a esenciálních MK. Mohou však být využívány i jako součást enterální i orální výživy.

Význam složení tuků v parenterální výživě pacientů

V oblasti nutriční farmakologie mohou být využívány i jako farmaka na základě nových poznatků o regulační úloze lipidů. MK jsou v lipidových výživách obsaženy ve formě triglyceridů (TG).

• LCT (“long chain” TG)

  Jsou získávány z rostlinných olejů s vysokým obsahem VNMK. Většinou je to sójový olej s vysokým obsahem n-6 LA. Existují i emulze, které obsahují n-3 VNMK jako je např. Omegaven nebo SMOFlipid. Zdrojem n-3 VNMK může být jak rybí tak řasový olej. S ohledem na možné regulační funkce těchto složek je důležitý poměr n-3:n-6 VNMK zejména např. s ohledem na protizánětlivé účinky. Cílem je tedy optimalizace složení těchto emulzí s ohledem na diagnózu, zejména u onkologických pacientů.

• MCT (“medium chain” TG)

  Představují nasycené MK (6–12 uhlíků) a slouží především jako zdroj energie a působí proti supresi imunitních a fagocytárních funkcí u silně stresovaných pacientů. Některé emulze jsou směsmi LCT/MCT.

Ukazuje se, že složení lipidových výživ může mít významné dopady na stav organizmu a jeho boj s onemocněním. Obecně ovlivňuje pooperační stavy, infekci, sepsi, hojení ran a je prokázáno, že využití n-3 VNMK jako součástí těchto lipidových výživ může mít pozitivní účinky, přispívá k rychlejšímu zotavení organizmu a zkracuje dobu pobytu v nemocnici. Důležité je prokázané pozitivní působení n-3 VNMK ve stavu nádorové kachexie, kde se snižuje produkce TNFα (kachektin), prozánětlivého cytokinu spojeného s kachexií a podporuje se činnost imunitního systému.

Bylo prokázáno, že složení lipidových emulzí ovlivňuje spektrum lipidů v plazmě i v membránách erytrocytů i buněk různých tkání, přičemž metabolizmus a obrat fosfolipidů v membránách transformovaných nádorových buněk se zásadně liší od buněk netransformovaných. Na základě výzkumů je známo, že změny ve složení fosfolipidů membrán mění její vlastnosti (fluiditu, produkci volných reaktivních radikálů a biologicky aktivních metabolitů – eikosanoidů), což se dále odráží ve schopnosti příjmu a přenosu signálů důležitých regulačních molekul s následnými účinky na důležité biologické procesy jako jsou buněčný růst, diferenciace a apoptóza a dále funkce buněk imunitního systému.

Změny membrán, signálování a růstových vlastnosti nádorových buněk po působení VNMK mohou také významně modulovat jejich citlivost k různým terapeutickým zásahům (chemoterapeutika, cytostatika) a mohou přispět k překonání rezistence. Ukazuje se, že kombinace n-3 VNMK s některými chemoterapeutiky (doxorubicin, fluorouracil, irinotecan, paclitaxel), které mají řadu vedlejších účinků, umožňuje snížit jejich dávku, redukuje vedlejší účinky a kachexii. K širšímu využití těchto dietetických složek je však potřeba přinést další vědecké důkazy jak v experimentální tak v klinické oblasti.

---